Trasporto pneumococcico rinofaringeo e orofaringeo negli adulti

Centro/i di ricerca:

La ricerca sarà svolta da:

1. Istituto di sanità pubblica della Vojvodina

   • Centro per il controllo e la prevenzione delle malattie e il Centro per la microbiologia

2. Centro Sanitario di Novi Sad

   • Dipartimento di Medicina Generale.

Elaborazione del campione Per confermare la presenza di NP e OP, il campionamento includerà i tamponi NP e OP. I tamponi saranno raccolti dai medici di medicina generale presso il Centro Sanitario di Novi Sad e saranno trasportati, entro 24 ore dalla raccolta, al Centro di Microbiologia dell'Istituto di Sanità Pubblica della Vojvodina, Novi Sad. I tamponi sterili con punta di cotone verranno inseriti nelle narici anteriori, strofinati delicatamente sulla parete del tampone NP e immediatamente posti nel terreno di trasporto (Copan Venturi Transystem, Brescia, Italia).

Procedura di laboratorio All'interno del laboratorio i tamponi NP saranno analizzati da 200 μl di terreno STGG inoculato con tampone saranno trasferiti in 5,0 ml di brodo Todd Hewitt contenente lo 0,5% di estratto di lievito (THY) e 1 ml di siero di coniglio e incubati a 35-37 °C per sei ore. Il brodo di coltura sarà piastrato su agar sangue di montone e incubato in 5% CO2 a 35-37 °C. Dopo 18-24 ore di incubazione, le piastre saranno esaminate per la comparsa di colonie alfa-emolitiche simili a streptococchi. I campioni positivi saranno messi in coltura e verranno eseguiti il ​​test del disco di optochina e la solubilità biliare.

Sierotipizzazione molecolare

Estrazione del DNA Per ottenere gli estratti di DNA per le reazioni di PCR, una crescita notturna della piastra di agar sangue sarà sospesa in 300 μl di NaCl 0.85%, riscaldata a 70 °C per 15 min, centrifugata per 2 min e il supernatante sarà rimosso. Il pellet sarà sospeso in 50 μl di tampone TE con l'aggiunta di 10 μl di mutanolisina e 8 μl di ialuronidasi, mantenuto a 37°C per 30 min (fino a una notte), riscaldato per 10 min a 100°C e centrifugato per 4 min. Non più di 2,5 μl di supernatante saranno utilizzati come templato di DNA. Gli estratti saranno conservati a -20°C fino al test PCR (9).

Identificazione di S. pneumoniae L'identificazione di S. pneumoniae sarà ottenuta amplificando il gene lytA utilizzando primer e sonde raccomandati da CDC e Quanta Biosciences PerfeCTa1 qPCR ToughMix1, Low RoxTM (Quanta Biosciences, Beverly, USA) (10). I campioni LytA positivi saranno ulteriormente analizzati per l'identificazione del sierotipo.

Identificazione del sierotipo I test PCR multiplex convenzionali saranno eseguiti come una serie di reazioni multiplex, utilizzando schemi e primer raccomandati dal CDC per la deduzione del sierotipo pneumococcico e 2X PCR Buffer - QIAGEN Multiplex PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germania). I prodotti di PCR saranno analizzati su gel di agarosio NuSieve al 2% (Cambrex Bio Science, Inc., Rockland, ME), colorati con bromuro di etidio. Le immagini gel verranno registrate con il sistema BioDocAnalyze (Analytik Jena, Jena, Germania).

La PCR in tempo reale verrà eseguita facoltativamente in caso di difficoltà con la PCR convenzionale. L'IT verrà eseguito, come una serie di 21 saggi monoplex che comprendono 21 sierotipi utilizzando gli schemi raccomandati dal CDC basati sulla prevalenza geografica dei sierotipi. I dosaggi sono multiplexati in un formato triplex sequenziale (tre bersagli/sierotipi in una reazione), ognuno dei quali rileva i bersagli sui canali FAM, Rox (o Cy5) e Hex. Le reazioni saranno eseguite su strumenti ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), utilizzando primer e sonde specifici e Invitrogen-Platinum Quantitive PCR SuperMix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA).

Test di sensibilità La sensibilità degli isolati Spn a Optochin, Oxacilin, Norfloxacin, Erytromycin, Clindamycin, Tetracycline e Trimetroprim-sulfometoxazole sarà determinata con il metodo Diffusion secondo il Comitato Europeo sui Test di Sensibilità Antimicrobica (EUCAST, www.eucast.org).

Questa valutazione di base viene presa in considerazione per presentare solo i risultati correnti descrittivi, ma non vengono presi in considerazione separatamente per l'analisi comparativa.

I risultati dei test di laboratorio, condotti per ciascun paziente, saranno inoltrati ai medici eletti che hanno indicato il campionamento del materiale del paziente.

Procedure dello studio Gli adulti saranno reclutati durante il loro esame sanitario presso il Centro sanitario di Novi Sad dal loro medico eletto.

Dopo aver fornito una spiegazione verbale e scritta dell'obiettivo della ricerca (Appendice 1), il consenso informato (Appendice 2) sarà ottenuto dai soggetti prima dell'arruolamento. Le informazioni personali e riservate ottenute dai partecipanti verranno rimosse, ad eccezione delle informazioni demografiche, tra cui data di campionamento, età, sesso, dati sulla precedente infezione del tratto respiratorio superiore, numero di bambini (fratelli) di età compresa tra 0 e 10 anni residenti nella famiglia dei partecipanti con anamnesi di immunizzazione pneumococcica e influenzale (poiché l'immunizzazione influenzale può prevenire le superinfezioni pneumococciche), abitudini al fumo dei partecipanti e dei loro familiari e informazioni sulla residenza (questionario del sondaggio - Appendice 3).

I campioni verranno forniti come un tampone NP per soggetto dello studio. Ogni partecipante verrà assegnato una sola volta.

Il caso confermato è ogni partecipante testato in laboratorio in cui, dopo il test (PCR o ELISA), si ottiene un risultato positivo.

Analisi statistica e giustificazione della dimensione del campione Raccolta dei dati Le caratteristiche di tutti gli intervistati acquisite tramite questionario da Novi Sad, i risultati dei test di laboratorio sui campioni dei partecipanti e la caratterizzazione finale dei sierotipi Spn verranno inseriti in un database appositamente progettato. Le informazioni personali dei partecipanti verranno rimosse.

L'investigatore della ricerca insieme allo statistico analizzerà i dati raccolti.

Giustificazione della dimensione del campione In conformità con il calcolo della dimensione del campione per uno studio che stima una prevalenza di popolazione (11), si prevede di raccogliere tra 350 e 500 campioni. Presumiamo di rilevare pneumococchi fino al 10% PCR-positivo per Spn. Il numero totale di adulti di età superiore ai 50 anni è di circa 120.000 e pertanto prevediamo di raccogliere il campione fino allo 0,4% della popolazione totale target.

Risultati attesi Dopo un'attenta implementazione della ricerca, ci aspettavamo che il portatore di Spn tra gli adulti di età superiore ai 50 anni fosse presente in meno del 10% della popolazione totale. Inoltre, presumiamo che i sierotipi Spn coperti da PPV o PCV rappresenteranno più del 60% e 50% dei sierotipi nella distribuzione complessiva tra i soggetti testati.

Metodi statistici Esamineremo le associazioni tra fattori di rischio e trasporto NP e OP di pneumococchi in partecipanti di età superiore ai 50 anni. I seguenti fattori saranno esaminati come possibili fattori di rischio nella popolazione coperta: età, sesso, dati sulla precedente infezione del tratto respiratorio superiore, numero di bambini (fratelli) di età compresa tra 0 e 10 anni residenti nella famiglia dei partecipanti con storia di immunizzazione pneumococcica e influenzale, le abitudini al fumo dei partecipanti e dei loro familiari e le informazioni sulla residenza. Questi fattori saranno analizzati mediante analisi univariate e multivariate (se del caso). Inoltre, verrà stimata la prevalenza del portatore di NP e OP come percentuale di partecipanti le cui colture rinofaringee erano positive per Spn e corrispondenti intervalli di confidenza al 95%. Tutte le analisi descrittive saranno eseguite utilizzando il software SPSS Statistics Versione 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).