Portage nasopharyngé et oropharyngé pneumococcique chez l'adulte

Centre(s) de recherche :

La recherche sera menée par :

1. Institut de santé publique de Voïvodine

   • Centre de contrôle et de prévention des maladies et Centre de microbiologie

2. Centre de santé de Novi Sad

   • Département de médecine générale.

Traitement des échantillons Pour confirmer le portage NP et OP, l'échantillonnage comprendra des écouvillons NP et OP. Les écouvillons seront collectés par les médecins généralistes du centre de soins de santé de Novi Sad et transportés, dans les 24 heures suivant la collecte, au centre de microbiologie de l'institut de santé publique de Voïvodine, Novi Sad. Les écouvillons stériles en fil de coton seront insérés dans les narines antérieures, frottés doucement sur la paroi de l'écouvillon NP et immédiatement placés dans un milieu de transport (Copan Venturi Transystem, Brescia, Italie).

Procédure de laboratoire Au sein du laboratoire, les écouvillons NP seront analysés par 200 μl de milieu STGG inoculé sur écouvillon seront transférés dans 5,0 ml de bouillon Todd Hewitt contenant 0,5% d'extrait de levure (THY) et 1 ml de sérum de lapin et incubés à 35-37 °C pendant six heures. Le bouillon de culture sera étalé sur de la gélose au sang de mouton et incubé dans 5 % de CO2 à 35-37 °C. Après 18-24 heures d'incubation, les boîtes seront examinées pour l'apparition de colonies alpha-hémolytiques ressemblant à des streptocoques. Les échantillons positifs seront cultivés et un test de solubilité du disque d'optochine et de la bile sera effectué.

Sérotypage moléculaire

Extraction d'ADN Pour obtenir des extraits d'ADN pour les réactions PCR, une plaque de croissance d'une nuit de gélose au sang sera mise en suspension dans 300 μl de NaCl à 0,85 %, chauffée à 70 °C pendant 15 min, centrifugée pendant 2 min et le surnageant sera éliminé. Le culot sera mis en suspension dans 50 ul de tampon TE additionné de 10 ul de mutanolysine et de 8 ul d'hyaluronidase, maintenu à 37 °C pendant 30 min (jusqu'au lendemain), chauffé pendant 10 min à 100 °C et centrifugé pendant 4 min. Pas plus de 2,5 μl de surnageant seront utilisés comme matrice d'ADN. Les extraits seront conservés à -20°C jusqu'au test PCR (9).

Identification de S. pneumoniae L'identification de S. pneumoniae sera réalisée en amplifiant le gène lytA à l'aide d'amorces et de sondes recommandées par le CDC et Quanta Biosciences PerfeCTa1 qPCR ToughMix1, Low RoxTM (Quanta Biosciences, Beverly, USA) (10). Les échantillons positifs pour LytA seront analysés plus en détail pour l'identification du sérotype.

Identification du sérotype Les tests de PCR multiplex conventionnels seront effectués sous la forme d'une série de réactions multiplex, en utilisant les schémas et les amorces recommandés par le CDC pour la déduction du sérotype pneumococcique et le tampon PCR 2X - Kit PCR multiplex QIAGEN (Qiagen, Hilden, Allemagne). Les produits de PCR seront analysés sur des gels d'agarose NuSieve à 2 % (Cambrex Bio Science, Inc., Rockland, ME), colorés au bromure d'éthidium. Les images de gel seront enregistrées dans le système BioDocAnalyze (Analytik Jena, Jena, Allemagne).

La PCR en temps réel sera effectuée en option en cas de difficultés avec la PCR conventionnelle. L'IT sera réalisée sous la forme d'une série de 21 tests monoplex englobant 21 sérotypes en utilisant les schémas recommandés par les CDC basés sur la prévalence géographique des sérotypes. Les tests sont multiplexés dans un format triplex séquentiel (trois cibles/sérotypes dans une réaction), chacun détectant les cibles sur les canaux FAM, Rox (ou Cy5) et Hex. Les réactions seront effectuées sur des instruments ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis), en utilisant des amorces et des sondes spécifiques et Invitrogen-Platinum Quantitive PCR SuperMix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis).

Tests de sensibilité La sensibilité des isolats de Spn à l'optochine, l'oxaciline, la norfloxacine, l'érytromycine, la clindamycine, la tétracycline et le trimétroprime-sulfométoxazole sera déterminée par la méthode de diffusion selon le Comité européen sur les tests de sensibilité aux antimicrobiens (EUCAST, www.eucast.org).

Cette évaluation de base prend en considération pour ne présenter que les résultats actuels descriptifs, mais ils ne sont pas pris en compte séparément pour l'analyse comparative.

Les résultats des tests de laboratoire, effectués pour chaque patient, seront transmis aux médecins élus qui ont indiqué l'échantillonnage du matériel du patient.

Procédures de l'étude Les adultes seront recrutés lors de leur examen de santé au Centre de soins de santé de Novi Sad par leur médecin élu.

Après avoir fourni une explication verbale et écrite du but de la recherche (annexe 1), le consentement éclairé (annexe 2) sera obtenu des sujets avant l'inscription. Les informations personnelles et confidentielles obtenues auprès des participants seront supprimées, à l'exception des informations démographiques, y compris la date d'échantillonnage, l'âge, le sexe, les données sur les infections antérieures des voies respiratoires supérieures, le nombre d'enfants (frères et sœurs) âgés de 0 à 10 ans résidant dans le ménage des participants. avec des antécédents de vaccination contre le pneumocoque et la grippe (car la vaccination contre la grippe peut prévenir les surinfections à pneumocoque), les habitudes tabagiques des participants et des membres de leur ménage et les informations sur la résidence à domicile (Questionnaire d'enquête - Annexe 3).

Les échantillons seront fournis sous la forme d'un écouvillon NP par sujet d'étude. Chaque participant ne sera assigné qu'une seule fois.

Un cas confirmé est tout participant testé en laboratoire pour lequel, après un test (PCR ou ELISA), un résultat positif est obtenu.

Analyse statistique et justification de la taille de l'échantillon Collecte des données Les caractéristiques de tous les répondants acquises par questionnaire de Novi Sad, les résultats des tests de laboratoire des échantillons de participants et la caractérisation finale des sérotypes Spn seront saisis dans une base de données spécialement conçue. Les informations personnelles des participants seront supprimées.

L'investigateur de la recherche et le statisticien analyseront les données collectées.

Justification de la taille de l'échantillon Conformément au calcul de la taille de l'échantillon pour une étude estimant une prévalence dans la population (11), il est prévu de collecter entre 350 et 500 échantillons. Nous supposons détecter les pneumocoques jusqu'à 10 % de PCR positive à Spn. Le nombre total d'adultes de plus de 50 ans est d'environ 120 000, et nous prévoyons donc de collecter l'échantillon jusqu'à 0,4 % de la population ciblée totale.

Résultats attendus Après une mise en œuvre minutieuse de la recherche, nous nous attendions à ce que le portage Spn chez les adultes de plus de 50 ans soit présent chez moins de 10 % de la population totale. De plus, nous supposons que les sérotypes Spn couverts par le PPV ou le PCV représenteront plus de 60 % et 50 % des sérotypes dans la distribution globale parmi les sujets testés.

Méthodes statistiques Nous examinerons les associations entre les facteurs de risque et le portage NP et OP des pneumocoques chez les participants âgés de plus de 50 ans. Les facteurs suivants seront examinés en tant que facteurs de risque possibles dans la population couverte : âge, sexe, données sur les infections antérieures des voies respiratoires supérieures, nombre d'enfants (frères et sœurs) âgés de 0 à 10 ans résidant dans le ménage des participants ayant des antécédents de vaccination contre le pneumocoque et la grippe, les habitudes tabagiques des participants et des membres de leur ménage et les informations sur la résidence à domicile. Ces facteurs seront analysés par des analyses univariées et multivariées (le cas échéant). En outre, la prévalence du portage NP et OP en tant que proportion de participants dont les cultures nasopharyngées étaient positives pour Spn et les intervalles de confiance à 95 % correspondants seront estimés. Toutes les analyses descriptives seront effectuées à l'aide du logiciel SPSS Statistics Version 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).