Pneumokokin aiheuttama nenänielun ja suunnielun kantaminen aikuisilla

Tutkimuskeskukset:

Tutkimuksen toteuttavat:

1. Vojvodinan kansanterveysinstituutti

   • Tautien torjunta- ja ehkäisykeskus ja mikrobiologian keskus

2. Novi Sadin terveyskeskus

   • Yleislääketieteen laitos.

Näytteen käsittely NP- ja OP-vaunun vahvistamiseksi näytteenotto sisältää NP- ja OP-puikkonäytteitä. Novi Sadin terveydenhuoltokeskuksen yleislääkärit keräävät pyyhkäisynäytteet, ja ne kuljetetaan 24 tunnin sisällä keräämisestä Vojvodinan kansanterveyslaitoksen mikrobiologian keskukseen Novi Sadiin. Steriilit puuvillakärkiset vanupuikot työnnetään anteriorisiin naruihin, hierotaan varovasti NP-puikon seinämään ja asetetaan välittömästi kuljetusaineeseen (Copan Venturi Transystem, Brescia, Italia).

Laboratoriotoimenpiteet Laboratoriossa NP-puikot analysoidaan 200 μl:lla vanupuikolla inokuloitua STGG-elatusainetta siirretään 5,0 ml:aan Todd Hewitt -lientä, joka sisältää 0,5 % hiivauutetta (THY) ja 1 ml kanin seerumia, ja inkuboidaan 35-37 °C:ssa. °C kuuden tunnin ajan. Viljelty liemi maljataan lampaanveriagarille ja inkuboidaan 5 % CO2:ssa 35-37 °C:ssa. 18-24 tunnin inkubaation jälkeen levyt tutkitaan streptokokkeja muistuttavien alfahemolyyttisten pesäkkeiden esiintymisen varalta. Positiivisia näytteitä viljellään ja optokiinilevy- ja sappiliukoisuustesti suoritetaan.

Molekyyliserotyypitys

DNA-uutto DNA-uutteiden saamiseksi PCR-reaktioita varten yön yli kasvatettu veri-agar-levy suspendoidaan 300 µl:aan 0,85 % NaCl:a, kuumennetaan 70 °C:seen 15 minuutiksi, pyöritetään 2 minuuttia ja supernatantti poistetaan. Pelletti suspendoidaan 50 µl:aan TE-puskuria, johon on lisätty 10 µl mutanolysiiniä ja 8 µl hyaluronidaasia, pidetään 37 °C:ssa 30 minuuttia (yön yli), kuumennetaan 10 minuuttia 100 °C:ssa ja pyöritetään 4 minuuttia. DNA-templaattina käytetään enintään 2,5 μl supernatanttia. Uutteita säilytetään -20 °C:ssa PCR-testaukseen asti (9).

S. pneumoniaen tunnistaminen S. pneumoniaen tunnistaminen saavutetaan monistamalla lytA-geeni käyttämällä CDC:n ja Quanta Biosciences PerfeCTa1 qPCR ToughMix1, Low RoxTM:n (Quanta Biosciences, Beverly, USA) suosittelemia alukkeita ja koettimia (10). LytA-positiivisia näytteitä analysoidaan edelleen serotyypin tunnistamiseksi.

Serotyypin tunnistaminen Perinteiset multipleksi-PCR-määritykset suoritetaan sarjana multipleksireaktioita käyttäen CDC:n suosittelemia järjestelmiä ja alukkeita pneumokokki-serotyypin vähentämiseen ja 2X PCR-puskuria - QIAGEN Multiplex PCR Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). PCR-tuotteet analysoidaan 2-prosenttisilla NuSieve-agaroosigeeleillä (Cambrex Bio Science, Inc., Rockland, ME), jotka on värjätty etidiumbromidilla. Geelikuvat tallennetaan BioDocAnalyze-järjestelmään (Analytik Jena, Jena, Saksa).

Reaaliaikainen PCR suoritetaan valinnaisesti, jos tavanomaisen PCR:n kanssa ilmenee vaikeuksia. IT suoritetaan sarjana 21 monoplex-määritystä, jotka sisältävät 21 serotyyppiä käyttäen CDC:n suosittelemia järjestelmiä, jotka perustuvat serotyyppien maantieteelliseen esiintyvyyteen. Määritykset multipleksoidaan peräkkäisessä triplex-muodossa (kolme kohdetta/serotyyppiä yhdessä reaktiossa), joista jokainen havaitsee kohteet FAM-, Rox- (tai Cy5)- ja Hex-kanavilla. Reaktiot suoritetaan ABI 7500 Instrumentsilla (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), käyttämällä erityisiä alukkeita ja koettimia sekä Invitrogen-Platinum Quantitive PCR SuperMixiä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA).

Herkkyystestaus Spn-isolaattien herkkyys Optochinille, Oksasiliinille, Norfloksasiinille, Erytromysiinille, Klindamysiinille, Tetrasykliinille ja Trimetroprim-sulfometoksatsolille määritetään diffuusiomenetelmällä Euroopan antimikrobisen herkkyystestauksen (EUCAST, www..org) mukaisesti.

Tässä lähtötilanteen arvioinnissa on otettu huomioon vain nykyisten kuvaavien tulosten esittäminen, mutta niitä ei oteta erikseen huomioon vertailevassa analyysissä.

Jokaiselle potilaalle suoritettujen laboratoriotutkimusten tulokset välitetään valituille lääkäreille, jotka ovat ilmoittaneet potilasmateriaalista näytteenoton.

Opiskelumenettelyt Aikuiset rekrytoidaan heidän valitsemansa lääkärin terveystarkastuksen aikana Novi Sadin terveyskeskuksessa.

Suullisen ja kirjallisen selvityksen jälkeen tutkimustavoitteesta (Liite 1) koehenkilöiltä hankitaan tietoinen suostumus (Liite 2) ennen ilmoittautumista. Osallistujilta saadut henkilökohtaiset ja luottamukselliset tiedot poistetaan, paitsi demografiset tiedot, mukaan lukien näytteenottopäivä, ikä, sukupuoli, tiedot aiemmasta ylähengitystieinfektiosta, osallistujien taloudessa asuvien 0-10-vuotiaiden lasten (sisarusten) lukumäärä. pneumokokki- ja influenssarokotushistoria (koska influenssarokotus voi estää pneumokokki-superinfektioita), osallistujien ja heidän perheenjäsentensä tupakointitottumukset ja kotiasumista koskevat tiedot (Tutkimuslomake - Liite 3).

Näytteet toimitetaan yhtenä NP-vanupuikkona tutkimuskohdetta kohti. Jokainen osallistuja määrätään vain kerran.

Vahvistettu tapaus on jokainen laboratoriotestattu osallistuja, jossa testin (PCR tai ELISA) jälkeen saadaan positiivinen tulos.

Tilastollinen analyysi ja näytteen koko Perustelu Tietojen kerääminen Kaikkien vastaajien Novi Sadista kyselylomakkeella hankitut ominaisuudet, osallistujien näytteiden laboratoriotestien testitulokset ja Spn-serotyyppien lopullinen karakterisointi tallennetaan erityisesti suunniteltuun tietokantaan. Osallistujien henkilötiedot poistetaan.

Tutkimuksen tutkija ja tilastotieteilijä analysoivat kerätyt tiedot.

Otoskoon perustelut Väestön esiintyvyyttä arvioivan tutkimuksen otoskokolaskelman mukaisesti (11) suunnitellaan kerättäväksi 350–500 näytettä. Oletamme havaitsevan pneumokokkeja jopa 10 %:ssa PCR-positiivisia Spn:lle. Yli 50-vuotiaita aikuisten kokonaismäärä on noin 120 000, joten otaksumme kerättävämme otokseen jopa 0,4 % koko kohdeväestöstä.

Odotetut tulokset Tutkimuksen huolellisen toteutuksen jälkeen odotimme, että yli 50-vuotiaiden aikuisten Spn-kuljetuksia esiintyy alle 10 %:lla koko väestöstä. Lisäksi oletamme, että PPV:n tai PCV:n kattamat Spn-serotyypit edustavat yli 60 % ja 50 % serotyypeistä kokonaisjakaumassa testattujen koehenkilöiden kesken.

Tilastolliset menetelmät Tutkimme riskitekijöiden ja pneumokokkien NP- ja OP-kantavuuden välisiä yhteyksiä yli 50-vuotiailla osallistujilla. Seuraavia tekijöitä tutkitaan mahdollisina riskitekijöinä suojatussa väestössä: ikä, sukupuoli, tiedot aiemmasta ylähengitystieinfektiosta, pneumokokki- ja influenssarokotuksen saaneiden osallistujien taloudessa asuvien 0-10-vuotiaiden lasten (sisarusten) lukumäärä, osallistujien ja heidän perheenjäsentensä tupakointitottumukset ja kotiasumista koskevat tiedot. Nämä tekijät analysoidaan yksi- ja monimuuttujaanalyyseillä (tarvittaessa). Arvioidaan myös NP- ja OP-kantavuuden esiintyvyys niiden osallistujien osuutena, joiden nenänielun viljelmät olivat positiivisia Spn:n suhteen ja vastaavat 95 %:n luottamusvälit. Kaikki kuvaavat analyysit suoritetaan käyttämällä SPSS Statistics -ohjelmiston versiota 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).