Пневмококковое носоглоточное и ротоглоточное носительство у взрослых

Исследовательский центр(ы):

Исследования будут проводиться:

1. Институт общественного здравоохранения Воеводины

   • Центр контроля и профилактики заболеваний и Центр микробиологии

2. Центр Здравоохранения Нови-Сада

   • Кафедра общей медицины.

Обработка проб Для подтверждения переноса NP и OP отбор проб будет включать мазки NP и OP. Мазки будут собираться врачами общей практики в Центре здравоохранения Нови-Сада и доставляться в течение 24 часов после сбора в Центр микробиологии Института общественного здравоохранения Воеводины, Нови-Сад. Стерильные проволочные тампоны с ватными наконечниками будут вставлены в передние ноздри, аккуратно протерты о стенку тампона NP и немедленно помещены в транспортную среду (Copan Venturi Transystem, Брешиа, Италия).

Лабораторная процедура В лаборатории мазки из НЧ будут проанализированы: 200 мкл инокулированной среды STGG перенесут в 5,0 мл бульона Тодда Хьюитта, содержащего 0,5% дрожжевого экстракта (THY) и 1 мл кроличьей сыворотки, и инкубируют при 35-37°С. °С в течение шести часов. Культивированный бульон помещают на агар с овечьей кровью и инкубируют в 5% CO2 при 35–37 °C. После 18-24 часов инкубации чашки проверяют на появление альфа-гемолитических колоний, напоминающих стрептококки. Положительные образцы будут культивированы, и будет проведен тест диска оптохина и растворимости в желчи.

Молекулярное серотипирование

Экстракция ДНК. Чтобы получить экстракты ДНК для ПЦР, пластинку с кровяным агаром в течение ночи суспендируют в 300 мкл 0,85% NaCl, нагревают до 70°C в течение 15 мин, вращают в течение 2 мин и удаляют надосадочную жидкость. Осадок суспендируют в 50 мкл буфера ТЕ с добавлением 10 мкл мутанолизина и 8 мкл гиалуронидазы, выдерживают при 37°С в течение 30 мин (до ночи), нагревают в течение 10 мин при 100°С и вращают в течение 4 мин. В качестве матрицы ДНК используют не более 2,5 мкл супернатанта. Экстракты будут храниться при температуре -20°C до ПЦР-тестирования (9).

Идентификация S. pneumoniae Идентификация S. pneumoniae будет достигнута путем амплификации гена lytA с использованием праймеров и зондов, рекомендованных CDC и Quanta Biosciences PerfeCTa1 qPCR ToughMix1, Low RoxTM (Quanta Biosciences, Беверли, США) (10). LytA-положительные образцы будут дополнительно проанализированы для идентификации серотипа.

Идентификация серотипа Обычные мультиплексные ПЦР-анализы будут проводиться в виде серии мультиплексных реакций с использованием рекомендованных CDC схем и праймеров для определения серотипа пневмококка и 2X PCR Buffer - QIAGEN Multiplex PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Продукты ПЦР будут анализировать на 2% агарозных гелях NuSieve (Cambrex Bio Science, Inc., Rockland, ME), окрашенных бромистым этидием. Изображения геля будут записаны системой BioDocAnalyze (Analytik Jena, Йена, Германия).

ПЦР в реальном времени будет проводиться дополнительно в случае каких-либо трудностей с обычной ПЦР. ИТ будет проводиться в виде серии из 21 моноплексного анализа, охватывающего 21 серотип, с использованием рекомендованных CDC схем, основанных на географической распространенности серотипов. Анализы мультиплексированы в формате последовательного триплекса (три мишени/серотипа в одной реакции), каждый из которых обнаруживает мишени на каналах FAM, Rox (или Cy5) и Hex. Реакции будут выполняться на приборах ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США) с использованием специальных праймеров и зондов и супермикса для количественной ПЦР Invitrogen-Platinum (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США).

Тестирование чувствительности Чувствительность изолятов Spn к оптохину, оксацилину, норфлоксацину, эритромицину, клиндамицину, тетрациклину и триметроприму-сульфометоксазолу будет определяться диффузионным методом в соответствии с Европейским комитетом по тестированию чувствительности к противомикробным препаратам (EUCAST, www.eucast.org).

Эта базовая оценка предназначена для представления описательных только текущих результатов, но они не учитываются отдельно для сравнительного анализа.

Результаты лабораторных исследований, проведенных для каждого больного, направляются избранным врачам, которые указали забор материала больного.

Процедуры исследования Взрослые будут набраны во время медицинского осмотра в Центре здравоохранения Нови-Сада выбранным ими врачом.

После предоставления устного и письменного объяснения цели исследования (Приложение 1) перед включением в исследование от субъектов будет получено информированное согласие (Приложение 2). Личная и конфиденциальная информация, полученная от участников, будет удалена, за исключением демографической информации, включая дату отбора проб, возраст, пол, данные о перенесенных инфекциях верхних дыхательных путей, количество детей (братьев и сестер) в возрасте 0-10 лет, проживающих в домохозяйстве участников. с историей иммунизации против пневмококка и гриппа (поскольку иммунизация против гриппа может предотвратить пневмококковые суперинфекции), привычками курения участников и членов их домохозяйств и информацией о домашнем проживании (Анкета для обследования - Приложение 3).

Образцы будут предоставлены в виде одного мазка NP на каждого субъекта исследования. Каждый участник будет назначен только один раз.

Подтвержденным случаем считается каждый участник лабораторного тестирования, у которого после тестирования (ПЦР или ИФА) получен положительный результат.

Статистический анализ и обоснование размера выборки Сбор данных Характеристики всех респондентов, полученные по анкете из Нови-Сада, результаты лабораторных исследований образцов участников и окончательная характеристика серотипов Spn будут занесены в специально разработанную базу данных. Личная информация участников будет удалена.

Исследователь исследования вместе со статистиком проанализирует собранные данные.

Обоснование размера выборки В соответствии с расчетом размера выборки для исследования, оценивающего распространенность среди населения (11), планируется собрать от 350 до 500 образцов. Мы предполагаем обнаруживать пневмококки у до 10% ПЦР-позитивных к Spn. Общее количество взрослых старше 50 лет составляет около 120 000 человек, поэтому мы ожидаем собрать до 0,4% от общей целевой совокупности.

Ожидаемые результаты После тщательного проведения исследования мы ожидали, что носительство Spn среди взрослых старше 50 лет будет присутствовать менее чем у 10% всего населения. Кроме того, мы предполагаем, что серотипы Spn, охватываемые PPV или PCV, будут составлять более 60% и 50% серотипов в общем распределении среди испытуемых.

Статистические методы Мы изучим ассоциации между факторами риска и НП- и ОП-носительством пневмококков у участников старше 50 лет. В качестве возможных факторов риска в охваченном населении будут рассмотрены следующие факторы: возраст, пол, данные о перенесенных ранее инфекциях верхних дыхательных путей, количество детей (братьев и сестер) в возрасте 0-10 лет, проживающих в домохозяйстве участников с пневмококковой и гриппозной иммунизацией в анамнезе, привычка курения участников и членов их домохозяйств и информация о домашнем проживании. Эти факторы будут проанализированы с помощью одномерного и многомерного анализов (если применимо). Кроме того, будет оцениваться распространенность носительства НП и ОП как доля участников, чьи носоглоточные культуры были положительными на СпН и соответствующие 95% доверительные интервалы. Все описательные анализы будут выполняться с использованием программного обеспечения SPSS Statistics версии 21.0 (IBM Corp., Армонк, штат Нью-Йорк, США).