Pneumokokken nasofaryngeaal en orofaryngeaal vervoer bij volwassenen

Onderzoekscentrum(s):

Het onderzoek wordt uitgevoerd door:

1. Instituut voor Volksgezondheid van Vojvodina

   • Centrum voor ziektebestrijding en -preventie en het Centrum voor Microbiologie

2. Gezondheidscentrum van Novi Sad

   • Afdeling Algemene Geneeskunde.

Monsterverwerking Om de NP- en OP-slede te bevestigen, omvat het nemen van monsters NP- en OP-swabs. Wattenstaafjes worden verzameld door de huisartsen in het gezondheidscentrum van Novi Sad en worden binnen 24 uur na verzameling vervoerd naar het centrum voor microbiologie van het Instituut voor Volksgezondheid van Vojvodina, Novi Sad. De steriele wattenstaafjes worden in de voorste neusgaten gestoken, zachtjes over de wand van het NP-staafje gewreven en onmiddellijk in transportmedium geplaatst (Copan Venturi Transystem, Brescia, Italië).

Laboratoriumprocedure In het laboratorium worden NP-swabs geanalyseerd door 200 μl STGG-medium met wattenstaafjes te analyseren, over te brengen naar 5,0 ml Todd Hewitt-bouillon met 0,5% gistextract (THY) en 1 ml konijnenserum en te incuberen bij 35-37°C. °C gedurende zes uur. Gekweekte bouillon wordt uitgeplaat op schapenbloed-agar en geïncubeerd in 5% CO2 bij 35-37 °C. Na 18-24 uur incubatie worden de platen onderzocht op het verschijnen van alfa-hemolytische kolonies die lijken op streptokokken. Positieve monsters worden gekweekt en er wordt een optochine-schijf- en galoplosbaarheidstest uitgevoerd.

Moleculaire serotypering

DNA-extractie Om DNA-extracten voor PCR-reacties te verkrijgen, wordt een bloedagarplaat gedurende de nacht gesuspendeerd in 300 μl 0,85% NaCl, gedurende 15 minuten verwarmd tot 70 °C, gedurende 2 minuten gecentrifugeerd en supernatant wordt verwijderd. Pellet wordt gesuspendeerd in 50 μl TE-buffer met een toevoeging van 10 μl mutanolysine en 8 μl hyaluronidase, gedurende 30 minuten op 37°C gehouden (tot 's nachts), gedurende 10 minuten verwarmd op 100°C en 4 minuten gecentrifugeerd. Er wordt niet meer dan 2,5 μl supernatant gebruikt als DNA-template. Extracten worden bewaard bij -20°C tot PCR-testen (9).

Identificatie van S. pneumoniae Identificatie van S. pneumoniae zal worden bereikt door het lytA-gen te amplificeren met behulp van primers en probes aanbevolen door CDC en Quanta Biosciences PerfeCTa1 qPCR ToughMix1, Low RoxTM (Quanta Biosciences, Beverly, VS) (10). LytA-positieve monsters zullen verder worden geanalyseerd op serotype-identificatie.

Serotype-identificatie Conventionele multiplex PCR-assays zullen worden uitgevoerd als een reeks multiplexreacties, met behulp van door de CDC aanbevolen schema's en primers voor pneumokokkenserotypedeductie en 2X PCR Buffer - QIAGEN Multiplex PCR Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland). De PCR-producten zullen worden geanalyseerd op 2% NuSieve-agarosegels (Cambrex Bio Science, Inc., Rockland, ME), gekleurd met ethidiumbromide. Gelbeelden worden opgenomen in het BioDocAnalyze-systeem (Analytik Jena, Jena, Duitsland).

Realtime PCR wordt optioneel uitgevoerd in geval van problemen met conventionele PCR. IT zal worden uitgevoerd als een reeks van 21 monoplex-assays die 21 serotypen omvatten met behulp van door de CDC aanbevolen schema's op basis van de geografische prevalentie van serotypen. De assays worden gemultiplext in een sequentieel triplex-formaat (drie targets/serotypes in één reactie), waarbij elk targets worden gedetecteerd op FAM-, Rox- (of Cy5)- en Hex-kanalen. Reacties zullen worden uitgevoerd op ABI 7500-instrumenten (Thermo Fisher Scientific, Waltham, VS), met behulp van specifieke primers en sondes en Invitrogen-Platinum Quantitive PCR SuperMix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, VS).

Gevoeligheidstesten De gevoeligheid van Spn-isolaten voor optochin, oxacilin, norfloxacine, erytromycine, clindamycine, tetracycline en trimetroprim-sulfometoxazol zal worden bepaald met behulp van de diffusiemethode volgens de Europese commissie voor antimicrobiële gevoeligheidstesten (EUCAST, www.eucast.org).

Deze basisbeoordeling houdt rekening met het presenteren van alleen beschrijvende huidige resultaten, maar ze worden niet afzonderlijk in aanmerking genomen voor vergelijkende analyse.

De resultaten van laboratoriumtests, uitgevoerd voor elke patiënt, zullen worden doorgestuurd naar gekozen artsen die hebben aangegeven dat patiëntenmateriaal moet worden afgenomen.

Studieprocedures Volwassenen worden gerekruteerd tijdens hun gezondheidsonderzoek in het gezondheidscentrum van Novi Sad door hun gekozen arts.

Na het geven van een mondelinge en schriftelijke uitleg van het onderzoeksdoel (bijlage 1), wordt geïnformeerde toestemming (bijlage 2) verkregen van proefpersonen vóór inschrijving. Persoonlijke en vertrouwelijke informatie verkregen van deelnemers zal worden verwijderd, met uitzondering van demografische informatie, inclusief datum van bemonstering, leeftijd, geslacht, gegevens over eerdere infectie van de bovenste luchtwegen, aantal kinderen (broers en zussen) van 0-10 jaar die in het huishouden van deelnemers wonen met een voorgeschiedenis van pneumokokken- en griepvaccinatie (omdat griepvaccinatie superinfecties door pneumokokken kan voorkomen), rookgewoonten van deelnemers en hun gezinsleden en de informatie over de woonplaats (enquêtevragenlijst bijlage 3).

Monsters worden verstrekt als één NP-uitstrijkje per proefpersoon. Elke deelnemer wordt slechts één keer toegewezen.

Bevestigd geval is elke laboratoriumgeteste deelnemer waarbij na testen (PCR of ELISA) een positief resultaat wordt verkregen.

Statistische analyse en steekproefomvang Rechtvaardiging Verzameling van de gegevens Kenmerken van alle respondenten verkregen door vragenlijst van Novi Sad, de testresultaten van laboratoriumtests van monsters van deelnemers en de uiteindelijke karakterisering van Spn-serotypen zullen worden ingevoerd in een speciaal ontworpen database. Persoonsgegevens van deelnemers worden verwijderd.

Onderzoeker van het onderzoek zal samen met statisticus de verzamelde gegevens analyseren.

Rechtvaardiging van de steekproefomvang In overeenstemming met de berekening van de steekproefomvang voor een studie die de prevalentie van een populatie schat (11), is het de bedoeling dat er tussen de 350 en 500 steekproeven worden genomen. We veronderstellen pneumokokken te detecteren in tot 10% PCR-positief voor Spn. Het totale aantal volwassenen ouder dan 50 jaar is ongeveer 120.000, en daarom verwachten we de steekproef te verzamelen tot 0,4% van de totale beoogde populatie.

Verwachte resultaten Na zorgvuldige uitvoering van het onderzoek verwachtten we dat Spn-dragerschap bij volwassenen ouder dan 50 jaar bij minder dan 10% van de totale bevolking zal voorkomen. Bovendien gaan we ervan uit dat Spn-serotypen die onder PPV of PCV vallen, meer dan 60% en 50% van de serotypen zullen vertegenwoordigen in de totale verdeling onder geteste proefpersonen.

Statistische methoden We zullen verbanden onderzoeken tussen risicofactoren en NP- en OP-dragerschap van pneumokokken bij deelnemers ouder dan 50 jaar. De volgende factoren zullen worden onderzocht als mogelijke risicofactoren in de behandelde populatie: leeftijd, geslacht, gegevens over eerdere infectie van de bovenste luchtwegen, aantal kinderen (broers en zussen) van 0-10 jaar dat in het huishouden woont van deelnemers met een voorgeschiedenis van immunisatie tegen pneumokokken en griep, rookgewoonten van deelnemers en hun huisgenoten en de informatie over de woning. Deze factoren zullen worden geanalyseerd door middel van univariate en multivariate analyses (indien van toepassing). Ook zal de prevalentie van NP- en OP-dragerschap worden geschat als het percentage deelnemers van wie de nasofaryngeale culturen positief waren voor Spn en de bijbehorende betrouwbaarheidsintervallen van 95%. Alle beschrijvende analyses worden uitgevoerd met behulp van de SPSS Statistics-software versie 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, VS).