小児における1型糖尿病の発症における粘膜関連不変T（MAIT）細胞と腸内微生物叢および粘膜との間のクロストーク (MAIT-DT1)

科目: マルチスタディ。 被験者は、ネッカー病小児病院の小児糖尿病および内分泌病棟と、アントニー病院の小児科に含まれます。

• 最近発症 (RO) n=40: 診断直後に新たに発症した患者が含まれます。
• リスクのある（AR）コホート n = 70：以前にHLA DR3およびDR4について陽性と検査されたT1D患者の定期的にスクリーニングされた兄弟は、研究の一部になるよう求められます。
• 対照 (C) コホート (n=50): 対照被験者は、内分泌検査のためにネッカー病院で受診する患者になります。
• 内視鏡検査のコントロール (CE) n= 20: ネッカー病院またはアントニー病院で UGI 内視鏡検査を受ける患者

分析：

MAIT 細胞分析: FACS 分析では、MAIT 細胞は CD3+ CD4- CD161high Vα7.2+ T 細胞として識別されます。 表面マーカーを分析して、活性化状態 (CD25、CD69、CD44)、消耗 (PD1、KLRG1、TIM3)、遊走能力 (CCR6) を決定し、Ki67 および BCL2 発現によって増殖と生存を分析します。 サイトカイン産生は、PMA-イオノマイシン活性化後に評価され、その後、IL-2、IFN-γ TNF-α、IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IL-17、およびグランザイムに対する抗体による細胞質内染色が続きます。 B. TCR 刺激 (枯渇) に応答する MAIT 細胞の能力を決定するために、特定の細菌リガンドの存在下で in vitro 刺激を行います。 活性化マーカーの発現はFACSによって分析され、サイトメトリーベースのアッセイによって上清に放出されたサイトカインが分析されます。

腸内細菌叢の分析: 糞便サンプルを収集し、嫌気性条件下で直接保管します。 1 時間以内にサンプルが処理されます。1 つの画分を等分して -80 °C で凍結し、別の画分を使用して MAIT リガンドのバイオアッセイ用の糞便上清を調製し、等分して凍結します。 WT3細胞株およびプレート結合MR117を使用したバイオアッセイにより、MAIT細胞リガンドの存在を測定するバイオアッセイ。 すべてのサンプルの 16S 配列決定と、バイオアッセイおよび 16S で得られた結果に従って、メタゲノム解析用に 10 個のサンプルが選択されます。

コクサッキー ウイルス B (CVB) 感染状態: コクサッキー ウイルス B に対する特異的抗体および腸内細菌叢サンプルにおける CVB 特異的 qPCR 測定が、3 つのコホートのすべての患者で実行され、q-PCR および免疫化学による腸粘膜の分析が行われます。患者のサブセットに対して実行されます。

腸の完全性: 研究者は、RO、RD、および AR グループ (> 5 歳、n=20) のサブサンプルで、ラクツロース-マンニトール テストを使用して腸の透過性を評価します。 簡単に言えば、一晩絶食した後、患者はラクツロース 5 g とマンニトール 2 g の溶液 50 ml を飲みます。 摂取前と摂取後5時間の間に尿を採取する。

腸粘膜分析: 患者のサブセット (トランスグルタミナーゼに対する抗体の投与量によって決定されるセリアック病のない) では、IUG 内視鏡検査中に十二指腸生検が得られます。 十二指腸生検は、8歳以上のRD被験者および4歳以上のCE被験者で実施されます。 これらの生検は、フコシルトランスフェラーゼ 2 (fut2)、タイトジャンクションタンパク質 (オクルディン、クローディン 4)、抗菌ペプチド (Reg3、LL37)、粘液成分 (ムチン 2) などの重要な上皮分子の発現について qPCR によって分析されます。 免疫細胞の機能は、IL-23、IL-17、IL-22、Foxp3、IL-10、TGFb、CVB などの主要なサイトカイン/分子についても q-PCR によって評価されます。

以前の研究に基づいて、サンプルサイズはAR、RO、およびCグループ間の統計的差異を許容する必要があります。 研究者らは、セロコンバージョン後であるが糖尿病発症前に、RO患者とリスクのある子供の血中MAIT細胞異常を観察することを期待しています。 この新しいデータは、予測モデルを強化します (予備データを参照)。 MAIT 細胞は細菌リガンドを認識するため、MAIT 細胞の変化は微生物叢の変化および/または CVB 感染と並行して発生する可能性があると仮定しています。 研究者らは、RO 児の腸粘膜異常の観察を予測しており、これらの異常の重症度は、MAIT 細胞欠損のレベルおよび CVB 感染の存在と相関している可能性があります。 研究者らは、MAIT 細胞が糖尿病へ​​の進行を示す新しいバイオマーカーであり、自己免疫疾患の攻撃性を示す機能的な免疫マーカーであることを示すことを期待しています。 そのため、この研究は、MAIT 細胞操作に基づく予防戦略の正確な治療域を決定することができます。