Interferenza tra le cellule T invarianti associate alla mucosa (MAIT) e il microbiota intestinale e la mucosa nello sviluppo del diabete di tipo 1 nei bambini (MAIT-DT1)

Materie: studio multiplo. I soggetti saranno inclusi nell'unità pediatrica di diabete ed endocrinologia dell'ospedale pediatrico Necker Sick e nell'unità pediatrica dell'ospedale ANTONY.

• Recente insorgenza (RO) n=40: i pazienti di nuova insorgenza saranno inclusi poco dopo la diagnosi.
• Coorte a rischio (AR) n=70: fratelli sottoposti a screening di routine di pazienti con T1D precedentemente risultati positivi per HLA DR3 e DR4 saranno invitati a far parte dello studio.
• Coorte di controllo (C) (n=50): i soggetti di controllo saranno pazienti consultati presso l'ospedale Necker per i test endocrini
• Controllo per endoscopia (CE) n= 20: pazienti consultati presso l'ospedale Necker o presso l'ospedale Antony per l'endoscopia UGI

Analisi:

Analisi delle cellule MAIT: per l'analisi FACS, le cellule MAIT saranno identificate come cellule T CD3+ CD4-CD161high Vα7.2+. I marcatori di superficie saranno analizzati per determinare il loro stato di attivazione (CD25, CD69, CD44), il loro esaurimento (PD1, KLRG1, TIM3), la loro capacità di migrazione (CCR6) e la loro proliferazione e sopravvivenza saranno analizzate mediante l'espressione di Ki67 e BCL2. La produzione di citochine sarà valutata dopo l'attivazione di PMA-ionomicina, seguita da colorazione intracitoplasmatica con anticorpi contro IL-2, IFN-γ TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 e granzima B. Per determinare la capacità delle cellule MAIT di rispondere alla stimolazione del TCR (esaurimento), la stimolazione in vitro sarà effettuata in presenza di ligandi batterici specifici. L'espressione del marcatore di attivazione sarà analizzata mediante FACS e le citochine rilasciate nel supernatante mediante saggio basato su citometria.

Analisi del microbiota intestinale: i campioni di feci vengono raccolti e conservati direttamente in condizioni anaerobiche. Entro un'ora i campioni vengono processati: una frazione viene aliquotata e congelata a -80°C e un'altra frazione viene utilizzata per preparare il surnatante fecale per il biodosaggio dei ligandi MAIT, aliquotato e congelato. Saggio biologico per misurare la presenza di ligandi cellulari MAIT mediante saggi biologici utilizzando la linea cellulare WT3 e MR117 legato alla piastra. Sequenziamento 16S di tutti i campioni e in base ai risultati ottenuti con il biodosaggio e 16S, 10 campioni saranno selezionati per l'analisi metagenomica.

Stato di infezione da virus B di Coxsackie (CVB): in tutti i pazienti delle tre coorti verranno eseguiti anticorpi specifici contro il virus B di coxsackie e la misurazione di qPCR specifica per CVB in campioni di microbiota intestinale e verrà eseguita l'analisi della mucosa intestinale mediante q-PCR e immunochimica eseguita su un sottogruppo di pazienti.

Integrità intestinale: gli investigatori valuteranno la permeabilità dell'intestino utilizzando il test del lattulosio-mannitolo in un sottocampione di gruppi RO, RD e AR (> 5 anni di età, n = 20). In breve, dopo un digiuno notturno, i pazienti berranno 50 ml di soluzione di 5 g di lattulosio e 2 g di mannitolo. L'urina sarà raccolta prima e 5 ore dopo l'ingestione.

Analisi della mucosa intestinale: in un sottogruppo di pazienti (senza malattia celiaca determinata dal dosaggio di anticorpi contro la transglutaminasi), le biopsie duodenali saranno ottenute durante un'endoscopia IUG. La biopsia duodenale verrà eseguita in soggetti RD di età superiore a 8 anni e in soggetti CE di età superiore a 4 anni. Queste biopsie saranno analizzate mediante qPCR per l'espressione di molecole epiteliali chiave come la fucosil transferasi 2 (fut2), le proteine ​​della giunzione stretta (occludina, claudin4), i peptidi antimicrobici (Reg3, LL37) e la componente del muco (mucina 2). La funzione delle cellule immunitarie sarà anche valutata mediante q-PCR per citochine/molecole chiave come IL-23, IL-17, IL-22, Foxp3, IL-10, TGFb e CVB.

Sulla base di studi precedenti, la dimensione del campione dovrebbe consentire differenze statistiche tra i gruppi AR, RO e C. I ricercatori prevedono di osservare anomalie delle cellule MAIT del sangue nei pazienti RO e in alcuni bambini a rischio dopo la sieroconversione ma prima dell'insorgenza del diabete. Questi nuovi dati rafforzeranno il nostro modello predittivo (vedi dati preliminari). Poiché le cellule MAIT riconoscono il ligando batterico, ipotizziamo che l'alterazione delle cellule MAIT possa verificarsi in parallelo con i cambiamenti del microbiota e/o l'infezione da CVB. Gli investigatori prevedono di osservare anomalie della mucosa intestinale nei bambini RO e la gravità di queste anomalie può essere correlata al livello di difetto delle cellule MAIT e alla presenza di infezione da CVB. I ricercatori si aspettano di dimostrare che le cellule MAIT rappresentano un nuovo biomarcatore della progressione verso il diabete, nonché un marcatore immunitario funzionale dell'aggressività della malattia autoimmune. In quanto tale, questo studio potrebbe determinare l'accurata finestra terapeutica per le strategie preventive basate sulla manipolazione delle cellule MAIT.