Conversa Entre Células T Invariantes Associadas à Mucosa (MAIT) e a Microbiota Intestinal e a Mucosa no Desenvolvimento de Diabetes Tipo 1 em Crianças (MAIT-DT1)

Disciplinas: Estudo múltiplo. Os indivíduos serão incluídos na unidade pediátrica de diabetes e endocrinologia no hospital infantil Necker Sick e na unidade pediátrica do hospital ANTONY.

• De início recente (RO) n=40: Novos pacientes de início serão incluídos logo após o diagnóstico.
• Coorte de risco (AR) n=70: Irmãos rastreados rotineiramente de pacientes com DM1 previamente testados positivos para HLA DR3 e DR4 serão convidados a fazer parte do estudo.
• Coorte de controle (C) (n = 50): os indivíduos de controle serão pacientes consultados no Hospital Necker para testes endócrinos
• Controle para Endoscopia (EC) n= 20: pacientes consultados no Hospital Necker ou no Hospital Antony para endoscopia UGI

Análise:

Análise de células MAIT: Para análise FACS, as células MAIT serão identificadas como células T CD3+ CD4-CD161high Vα7.2+. Os marcadores de superfície serão analisados ​​para determinar seu estado de ativação (CD25, CD69, CD44), sua exaustão (PD1, KLRG1, TIM3), sua capacidade de migração (CCR6) e sua proliferação e sobrevivência serão analisados ​​pela expressão de Ki67 e BCL2. A produção de citocinas será avaliada após ativação de PMA-ionomicina, seguida de coloração intracitoplasmática com anticorpos contra IL-2, IFN-γ TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 e granzima B. Para determinar a capacidade das células MAIT de responder à estimulação do TCR (exaustão), a estimulação in vitro será realizada na presença de ligantes bacterianos específicos. A expressão do marcador de ativação será analisada por FACS e as citocinas liberadas no sobrenadante por ensaio baseado em citometria.

Análise da microbiota intestinal: amostras de fezes são coletadas e mantidas diretamente sob condições anaeróbicas. Em uma hora as amostras são processadas: uma fração é aliquotada e congelada a -80°C e outra fração é usada para preparar o sobrenadante fecal para o bioensaio de ligantes MAIT, aliquotado e congelado. Bioensaio para medir a presença de ligantes de células MAIT por bioensaios usando linha celular WT3, bem como MR117 ligado à placa. Sequenciamento 16S de todas as amostras e de acordo com os resultados obtidos com o bioensaio e 16S, 10 amostras serão selecionadas para análise metagenômica.

Status da infecção pelo vírus Coxsackie B (CVB): Anticorpos específicos contra o vírus coxsackie B e medição qPCR específica de CVB em amostras de microbiota intestinal serão realizadas em todos os pacientes das três coortes, e a análise da mucosa intestinal por q-PCR e imunoquímica será realizada em um subconjunto de pacientes.

Integridade do intestino: os investigadores avaliarão a permeabilidade do intestino usando o teste Lactulose-Manitol em uma subamostra dos grupos RO, RD e AR (> 5 anos de idade, n=20). Em breve, após um jejum noturno, os pacientes beberão 50 ml de solução de 5 g de lactulose e 2 g de manitol. A urina será coletada antes e 5 horas após a ingestão.

Análise da mucosa intestinal: Em um subconjunto de pacientes (sem doença celíaca conforme determinado pela dosagem de anticorpos contra a transglutaminase), biópsias duodenais serão obtidas durante uma endoscopia IUG. A biópsia duodenal será realizada em indivíduos RD com mais de 8 anos de idade e em indivíduos CE com mais de 4 anos de idade. Essas biópsias serão analisadas por qPCR para a expressão de moléculas epiteliais chave, como a fucosil transferase 2 (fut2), proteínas de junções apertadas (ocludina, claudina4), peptídeos antimicrobianos (Reg3, LL37) e componentes mucosos (mucina 2). A função das células imunes também será avaliada por q-PCR para citocinas/moléculas chave como IL-23, IL-17, IL-22, Foxp3, IL-10, TGFb e CVB.

Com base em estudo anterior, o tamanho da amostra deve permitir diferenças estatísticas entre os grupos AR, RO e C. Os investigadores esperam observar anormalidades nas células MAIT do sangue em pacientes com RO e algumas crianças em risco após a soroconversão, mas antes do início do diabetes. Esses novos dados fortalecerão nosso modelo preditivo (ver dados preliminares). Uma vez que as células MAIT reconhecem o ligante bacteriano, levantamos a hipótese de que a alteração das células MAIT pode ocorrer em paralelo com alterações da microbiota e/ou infecção por CVB. Os investigadores esperam observar anormalidades da mucosa intestinal em crianças com RO e a gravidade dessas anormalidades pode estar correlacionada com o nível de defeito das células MAIT e a presença de infecção CVB. Os pesquisadores esperam demonstrar que as células MAIT representam um novo biomarcador de progressão para o diabetes, bem como um marcador imunológico funcional da agressividade da doença autoimune. Como tal, este estudo pode determinar a janela terapêutica precisa para estratégias preventivas baseadas na manipulação de células MAIT.