Übersprechen zwischen Schleimhaut-assoziierten invarianten T (MAIT)-Zellen und der Darmmikrobiota und Schleimhaut bei der Entwicklung von Typ-1-Diabetes bei Kindern (MAIT-DT1)

Fächer: Multi-Studium. Die Probanden werden in die pädiatrische Diabetes- und Endokrinologieabteilung des Necker Sick-Kinderkrankenhauses und in die pädiatrische Abteilung des ANTONY-Krankenhauses aufgenommen.

• Recent-onset (RO) n=40: Neu aufgetretene Patienten werden kurz nach der Diagnose aufgenommen.
• Risikokohorte (AR) n = 70: Routinemäßig gescreente Geschwister von T1D-Patienten, die zuvor positiv auf HLA DR3 und DR4 getestet wurden, werden gebeten, an der Studie teilzunehmen.
• Kontrollkohorte (C) (n = 50): Kontrollpersonen werden Patienten sein, die das Necker Hospital für endokrine Tests konsultieren
• Kontrolle für Endoskopie (CE) n= 20: Patienten, die das Necker Hospital oder das Antony Hospital für eine UGI-Endoskopie konsultieren

Analyse:

MAIT-Zellanalyse: Für die FACS-Analyse werden MAIT-Zellen als CD3+ CD4-CD161high Vα7.2+ T-Zellen identifiziert. Oberflächenmarker werden analysiert, um ihren Aktivierungsstatus (CD25, CD69, CD44), ihre Erschöpfung (PD1, KLRG1, TIM3), ihre Migrationsfähigkeit (CCR6) und ihre Proliferation und ihr Überleben anhand der Ki67- und BCL2-Expression zu bestimmen. Die Zytokinproduktion wird nach PMA-Ionomycin-Aktivierung bewertet, gefolgt von einer intrazytoplasmatischen Färbung mit Antikörpern gegen IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 und Granzym B. Um die Fähigkeit von MAIT-Zellen zur Reaktion auf eine TCR-Stimulation (Erschöpfung) zu bestimmen, wird eine In-vitro-Stimulation in Gegenwart spezifischer bakterieller Liganden durchgeführt. Die Aktivierungsmarkerexpression wird durch FACS und die im Überstand freigesetzten Zytokine durch einen auf Zytometrie basierenden Assay analysiert.

Darmmikrobiota-Analyse: Stuhlproben werden gesammelt und direkt unter anaeroben Bedingungen gehalten. Innerhalb einer Stunde werden die Proben verarbeitet: Eine Fraktion wird aliquotiert und bei -80 °C eingefroren, und eine andere Fraktion wird zur Herstellung von Stuhlüberstand für den Bioassay von MAIT-Liganden verwendet, aliquotiert und eingefroren. Bioassay zur Messung des Vorhandenseins von MAIT-Zellliganden durch Bioassays unter Verwendung der WT3-Zelllinie sowie plattengebundenem MR117. 16S-Sequenzierung aller Proben und gemäß den mit dem Bioassay und 16S erhaltenen Ergebnissen werden 10 Proben für die metagenomische Analyse ausgewählt.

Coxsackie-Virus B (CVB)-Infektionsstatus: Bei allen Patienten der drei Kohorten werden spezifische Antikörper gegen Coxsackie-Virus B und CVB-spezifische qPCR-Messungen in Darmmikrobiota-Proben durchgeführt und die Darmschleimhaut durch q-PCR und Immunchemie analysiert an einer Untergruppe von Patienten durchgeführt.

Darmintegrität: Die Prüfärzte werden die Permeabilität des Darms unter Verwendung des Lactulose-Mannitol-Tests in einer Unterstichprobe der RO-, RD- und AR-Gruppen (> 5 Jahre alt, n = 20) beurteilen. Kurz gesagt, nach einer nächtlichen Fastenzeit trinken die Patienten 50 ml Lösung aus 5 g Lactulose und 2 g Mannit. Der Urin wird vor und 5 Stunden nach der Einnahme gesammelt.

Darmschleimhautanalyse: Bei einer Untergruppe von Patienten (ohne Zöliakie, bestimmt durch die Dosierung von Antikörpern gegen Transglutaminase) werden während einer IUG-Endoskopie Zwölffingerdarmbiopsien entnommen. Eine Zwölffingerdarmbiopsie wird bei RD-Patienten über 8 Jahren und bei CE-Patienten über 4 Jahren durchgeführt. Diese Biopsien werden mittels qPCR auf die Expression wichtiger Epithelmoleküle wie Fucosyltransferase 2 (fut2), Tight Junction Proteins (Occludin, Claudin4), antimikrobielle Peptide (Reg3, LL37) und Schleimkomponente (Mucin 2) analysiert. Die Funktion der Immunzellen wird auch durch q-PCR für wichtige Zytokine/Moleküle wie IL-23, IL-17, IL-22, Foxp3, IL-10, TGFb und CVB bewertet.

Basierend auf früheren Studien sollte die Stichprobengröße statistische Unterschiede zwischen AR-, RO- und C-Gruppen zulassen. Die Forscher gehen davon aus, Anomalien der Blut-MAIT-Zellen bei RO-Patienten und einigen gefährdeten Kindern nach der Serokonversion, aber vor dem Ausbruch von Diabetes, zu beobachten. Diese neuen Daten werden unser Vorhersagemodell stärken (siehe vorläufige Daten). Da MAIT-Zellen bakterielle Liganden erkennen, nehmen wir an, dass MAIT-Zellen-Veränderungen parallel zu Mikrobiota-Veränderungen und/oder CVB-Infektion auftreten könnten. Die Forscher rechnen mit der Beobachtung von Anomalien der Darmschleimhaut bei RO-Kindern, und die Schwere dieser Anomalien kann mit dem Ausmaß des MAIT-Zelldefekts und dem Vorhandensein einer CVB-Infektion korrelieren. Die Forscher erwarten zu zeigen, dass MAIT-Zellen einen neuen Biomarker für das Fortschreiten zu Diabetes sowie einen funktionellen Immunmarker für die Aggressivität der Autoimmunerkrankung darstellen. Als solche könnte diese Studie das genaue therapeutische Fenster für vorbeugende Strategien basierend auf der Manipulation von MAIT-Zellen bestimmen.