Diaphonie entre les cellules T invariantes associées aux muqueuses (MAIT) et le microbiote intestinal et la muqueuse dans le développement du diabète de type 1 chez les enfants (MAIT-DT1)

Sujets : étude multiple. Les sujets seront inclus dans l'unité de diabète pédiatrique et d'endocrinologie de l'hôpital pédiatrique Necker Sick et dans l'unité pédiatrique de l'hôpital ANTONY.

• Apparition récente (RO) n=40 : les nouveaux patients seront inclus peu de temps après le diagnostic.
• Cohorte à risque (AR) n = 70 : les frères et sœurs systématiquement dépistés de patients DT1 précédemment testés positifs pour HLA DR3 et DR4 seront invités à faire partie de l'étude.
• Cohorte témoin (C) (n=50) : les sujets témoins seront des patients consultant à l'hôpital Necker pour des tests endocriniens
• Témoin pour Endoscopie (CE) n= 20 : patients consultant à l'hôpital Necker ou à l'hôpital d'Antony pour endoscopie UGI

Analyse:

Analyse des cellules MAIT : Pour l'analyse FACS, les cellules MAIT seront identifiées comme des cellules T CD3+ CD4- CD161high Vα7.2+. Les marqueurs de surface seront analysés pour déterminer leur statut d'activation (CD25, CD69, CD44), leur épuisement (PD1, KLRG1, TIM3), leur capacité de migration (CCR6), et leur prolifération et survie seront analysés par l'expression de Ki67 et BCL2. La production de cytokines sera évaluée après l'activation de la PMA-ionomycine, suivie d'une coloration intracytoplasmique avec des anticorps contre l'IL-2, l'IFN-γ, le TNF-α, l'IL-2, l'IL-4, l'IL-10, l'IL-13, l'IL-17 et le granzyme B. Pour déterminer la capacité des cellules MAIT à répondre à la stimulation du TCR (épuisement), une stimulation in vitro sera réalisée en présence de ligands bactériens spécifiques. L'expression du marqueur d'activation sera analysée par FACS et les cytokines libérées dans le surnageant par un test basé sur la cytométrie.

Analyse du microbiote intestinal : Des échantillons de selles sont prélevés et directement conservés en condition anaérobie. En une heure, les échantillons sont traités : une fraction est aliquotée et congelée à -80 °C et une autre fraction est utilisée pour préparer le surnageant fécal pour le dosage biologique des ligands MAIT, aliquoté et congelé. Essai biologique pour mesurer la présence de ligands de cellules MAIT par des essais biologiques utilisant la lignée cellulaire WT3 ainsi que le MR117 lié à la plaque. Séquençage 16S de tous les échantillons et selon les résultats obtenus avec le bioessai et le 16S, 10 échantillons seront sélectionnés pour l'analyse métagénomique.

Statut d'infection par le virus Coxsackie B (CVB) : des anticorps spécifiques contre le virus coxsackie B et une mesure qPCR spécifique du CVB dans des échantillons de microbiote intestinal seront effectuées chez tous les patients des trois cohortes, et l'analyse de la muqueuse intestinale par q-PCR et immunochimie sera effectuée. réalisée sur un sous-ensemble de patients.

Intégrité intestinale : les enquêteurs évalueront la perméabilité de l'intestin à l'aide du test Lactulose-Mannitol dans un sous-échantillon des groupes RO, RD et AR (> 5 ans, n = 20). En bref après une nuit de jeûne, les patients boiront 50 ml de solution de 5 g de lactulose et 2 g de mannitol. L'urine sera recueillie avant et 5 heures après l'ingestion.

Analyse de la muqueuse intestinale : dans un sous-ensemble de patients (sans maladie coeliaque déterminée par le dosage des anticorps contre la transglutaminase), des biopsies duodénales seront obtenues lors d'une endoscopie IUG . La biopsie duodénale sera réalisée chez les sujets RD âgés de plus de 8 ans et chez les sujets CE âgés de plus de 4 ans. Ces biopsies seront analysées par qPCR pour l'expression de molécules épithéliales clés telles que la fucosyl transférase 2 (fut2), les protéines des jonctions serrées (occludine, claudine4), les peptides antimicrobiens (Reg3, LL37) et le composant du mucus (mucine 2). La fonction des cellules immunitaires sera également évaluée par q-PCR pour les cytokines/molécules clés telles que IL-23, IL-17, IL-22, Foxp3, IL-10, TGFb et CVB.

Sur la base d'une étude précédente, la taille de l'échantillon devrait permettre des différences statistiques entre les groupes AR, RO et C. Les chercheurs prévoient d'observer des anomalies des cellules sanguines MAIT chez les patients RO et certains enfants à risque après la séroconversion mais avant l'apparition du diabète. Ces nouvelles données viendront renforcer notre modèle prédictif (voir données préliminaires). Étant donné que les cellules MAIT reconnaissent le ligand bactérien, nous émettons l'hypothèse que l'altération des cellules MAIT pourrait se produire parallèlement aux modifications du microbiote et/ou à l'infection par le CVB. Les chercheurs prévoient d'observer des anomalies de la muqueuse intestinale chez les enfants RO et la gravité de ces anomalies peut être corrélée au niveau de défaut des cellules MAIT et à la présence d'une infection à CVB. Les chercheurs espèrent démontrer que les cellules MAIT représentent un nouveau biomarqueur de progression vers le diabète ainsi qu'un marqueur immunitaire fonctionnel de l'agressivité de la maladie auto-immune. En tant que telle, cette étude pourrait déterminer la fenêtre thérapeutique précise pour les stratégies préventives basées sur la manipulation des cellules MAIT.