Overspraak tussen mucosaal-geassocieerde invariante T-cellen (MAIT) en de darmmicrobiota en -mucosa bij de ontwikkeling van diabetes type 1 bij kinderen (MAIT-DT1)

Onderwerpen: Meerstudie. Onderwerpen zullen worden opgenomen in de afdeling pediatrische diabetes en endocrinologie in het Necker Sick-kinderziekenhuis en in de pediatrische afdeling van het ANTONY-ziekenhuis.

• Recent onset (RO) n=40: Nieuwe patiënten zullen kort na de diagnose worden opgenomen.
• Risicocohort (AR) n=70: Routinematig gescreende broers en zussen van T1D-patiënten die eerder positief testten op HLA DR3 en DR4 zullen worden gevraagd om deel te nemen aan het onderzoek.
• Controle (C) cohort (n=50): Controlepersonen zullen patiënten zijn die in het Necker-ziekenhuis consulteren voor endocriene testen
• Controle voor endoscopie (CE) n= 20: patiënten raadplegen Necker Ziekenhuis of Antony ziekenhuis voor UGI endoscopie

Analyse:

MAIT-celanalyse: Voor FACS-analyse zullen MAIT-cellen worden geïdentificeerd als CD3+ CD4-CD161 hoge Vα7.2+ T-cellen. Oppervlaktemarkers zullen worden geanalyseerd om hun activeringsstatus (CD25, CD69, CD44), hun uitputting (PD1, KLRG1, TIM3), hun migratiecapaciteit (CCR6) en hun proliferatie en overleving te bepalen door Ki67- en BCL2-expressie. Cytokineproductie zal worden beoordeeld na activering van PMA-ionomycine, gevolgd door intracytoplasmatische kleuring met antilichamen tegen IL-2, IFN-γ TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 en granzyme B. Om het vermogen van MAIT-cellen om te reageren op TCR-stimulatie (uitputting) te bepalen, zal in vitro stimulatie worden uitgevoerd in aanwezigheid van specifieke bacteriële liganden. Activeringsmarkerexpressie zal worden geanalyseerd door FACS en cytokines die vrijkomen in het supernatant door middel van op cytometrie gebaseerde assay.

Darmmicrobiota-analyse: ontlastingsmonsters worden verzameld en direct onder anaerobe omstandigheden gehouden. Binnen een uur worden de monsters verwerkt: een fractie wordt in porties verdeeld en ingevroren bij -80°C en een andere fractie wordt gebruikt om fecaal supernatant te bereiden voor de bioassay van MAIT-liganden, in porties verdeeld en ingevroren. Bioassay om de aanwezigheid van MAIT-celliganden te meten door middel van bioassays met WT3-cellijn en plaatgebonden MR117. 16S-sequencing van alle monsters en volgens de resultaten verkregen met de bioassay en 16S, zullen 10 monsters worden geselecteerd voor metagenomische analyse.

Coxsackie virus B (CVB) infectiestatus: Specifieke antilichamen tegen coxsackie virus B en CVB-specifieke-qPCR-metingen in darmmicrobiota-monsters zullen worden uitgevoerd bij alle patiënten van de drie cohorten, en analyse van het darmslijmvlies door middel van q-PCR en immunochemie zal worden uitgevoerd. uitgevoerd op een subgroep van patiënten.

Darmintegriteit: de onderzoekers zullen de doorlaatbaarheid van de darm beoordelen met behulp van de Lactulose-Mannitol-test in een submonster van RO-, RD- en AR-groepen (> 5 jaar, n=20). In het kort na een nacht vasten drinken de patiënten 50 ml oplossing van 5 g lactulose en 2 g mannitol. Urine wordt verzameld vóór en 5 uur na inname.

Darmslijmvliesanalyse: Bij een subgroep van patiënten (zonder coeliakie zoals bepaald door de dosering van antilichamen tegen transglutaminase), zullen duodenale biopsieën worden verkregen tijdens een IUG-endoscopie. Duodenale biopsie zal worden uitgevoerd bij RD-patiënten ouder dan 8 jaar en bij CE-patiënten ouder dan 4 jaar. Deze biopsieën zullen door qPCR worden geanalyseerd op de expressie van belangrijke epitheelmoleculen zoals het fucosyltransferase 2 (fut2), tight junction-eiwitten (occludin, claudin4), antimicrobiële peptiden (Reg3, LL37) en mucuscomponent (mucin 2). De functie van immuuncellen zal ook worden beoordeeld door middel van q-PCR voor belangrijke cytokines/moleculen zoals IL-23, IL-17, IL-22, Foxp3, IL-10, TGFb en CVB.

Op basis van eerder onderzoek zou de steekproefomvang statistische verschillen tussen AR-, RO- en C-groepen mogelijk moeten maken. De onderzoekers verwachten MAIT-celafwijkingen in het bloed waar te nemen bij RO-patiënten en sommige risicokinderen na seroconversie maar vóór het begin van de diabetes. Deze nieuwe gegevens zullen ons voorspellend model versterken (zie voorlopige gegevens). Aangezien MAIT-cellen bacterieel ligand herkennen, veronderstellen we dat wijziging van MAIT-cellen parallel kan optreden met veranderingen in de microbiota en/of CVB-infectie. De onderzoekers anticiperen op het waarnemen van afwijkingen in het darmslijmvlies bij RO-kinderen en de ernst van deze afwijkingen kan correleren met het niveau van defecte MAIT-cellen en de aanwezigheid van CVB-infectie. De onderzoekers verwachten aan te tonen dat MAIT-cellen een nieuwe biomarker vertegenwoordigen voor progressie naar diabetes, evenals een functionele immuunmarker voor de agressiviteit van de auto-immuunziekte. Als zodanig zou deze studie het juiste therapeutische venster kunnen bepalen voor preventieve strategieën op basis van MAIT-celmanipulatie.