Krysstale mellom slimhinne-assosierte invariante T-celler (MAIT) og tarmmikrobiota og slimhinne i utviklingen av type 1-diabetes hos barn (MAIT-DT1)

Fag: Flerstudium. Forsøkspersonene vil bli inkludert i den pediatriske enheten for diabetes og endokrinologi i Necker Sick barnesykehuset og i den pediatriske enheten til ANTONY sykehus.

• Nylig debutert (RO) n=40: Nyoppståtte pasienter vil inkluderes kort tid etter diagnose.
• Risikokohort (AR) n=70: Rutinemessig screenede søsken til T1D-pasienter som tidligere har testet positivt for HLA DR3 og DR4 vil bli bedt om å være en del av studien.
• Kontroll (C) kohort (n=50): Kontrollpersoner vil være pasienter som konsulteres ved Necker sykehus for endokrin testing
• Kontroll for endoskopi (CE) n= 20: pasienter som konsulterer ved Necker sykehus eller ved Antony sykehus for UGI endoskopi

Analyse:

MAIT-celleanalyse: For FACS-analyse vil MAIT-celler bli identifisert som CD3+ CD4-CD161high Vα7.2+ T-celler. Overflatemarkører vil bli analysert for å bestemme deres aktiveringsstatus (CD25, CD69, CD44), deres utmattelse (PD1, KLRG1, TIM3), deres migrasjonskapasitet (CCR6), og deres spredning og overlevelse vil bli analysert ved Ki67 og BCL2 uttrykk. Cytokinproduksjon vil bli vurdert etter PMA-ionomycin-aktivering, etterfulgt av intracytoplasmatisk farging med antistoffer mot IL-2, IFN-γ TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 og granzyme B. For å bestemme kapasiteten til MAIT-celler til respons på TCR-stimulering (utmattelse), vil in vitro-stimulering utføres i nærvær av spesifikke bakterielle ligander. Aktiveringsmarkøruttrykk vil bli analysert av FACS og cytokiner frigitt i supernatanten ved cytometribasert analyse.

Tarmmikrobiotaanalyse: Avføringsprøver samles inn og holdes direkte under anaerob tilstand. I løpet av en time behandles prøvene: en fraksjon blir delt i alikvoter og frosset ved -80°C og en annen fraksjon brukes til å fremstille fekal supernatant for bioassay av MAIT-ligander, delt opp og frosset. Bioassay for å måle tilstedeværelsen av MAIT-celleligander ved bioassays ved bruk av WT3-cellelinje samt platebundet MR117. 16S sekvensering av alle prøver og i henhold til resultatene oppnådd med bioanalysen og 16S, vil 10 prøver bli valgt for metagenomisk analyse.

Coxsackie virus B (CVB) infeksjonsstatus: Spesifikke antistoffer mot coxsackie virus B og CVB spesifikk-qPCR måling i tarmmikrobiota prøver vil bli utført hos alle pasienter i de tre kohortene, og analyse av tarmslimhinnen ved q-PCR og immunkjemi vil bli utført. utført på en undergruppe av pasienter.

Tarmintegritet: etterforskerne vil vurdere permeabiliteten til tarmen ved å bruke Lactulose-Mannitol-testen i en underprøve av RO-, RD- og AR-grupper (> 5 år, n=20). Kort oppsummert vil pasientene etter faste over natten drikke 50 ml oppløsning av 5 g laktulose og 2 g mannitol. Urin vil bli samlet opp før og 5 timer etter inntak.

Tarmslimhinneanalyse: Hos en undergruppe av pasienter (uten cøliaki som bestemt av dosen av antistoffer mot transglutaminase), vil duodenale biopsier bli tatt under en IUG-endoskopi. Duodenal biopsi vil bli utført hos RD-personer eldre enn 8 år og hos CE-personer eldre enn 4 år. Disse biopsiene vil bli analysert med qPCR for ekspresjon av nøkkelepitelmolekyler som fucosyltransferase 2 (fut2), tight junction-proteiner (occludin, claudin4), antimikrobielle peptider (Reg3, LL37) og slimkomponent (mucin 2). Immuncellers funksjon vil også bli vurdert ved q-PCR for nøkkelcytokiner/molekyler som IL-23, IL-17, IL-22, Foxp3, IL-10, TGFb og CVB.

Basert på tidligere studie, bør utvalgsstørrelsen tillate statistiske forskjeller mellom AR-, RO- og C-grupper. Etterforskerne forventer å observere MAIT-celleabnormiteter i blod hos RO-pasienter og noen risikobarn etter serokonversjon, men før diabetes debut. Disse nye dataene vil styrke vår prediktive modell (se foreløpige data). Siden MAIT-celler gjenkjenner bakteriell ligand, antar vi at MAIT-celleendring kan skje parallelt med mikrobiotaendringer og/eller CVB-infeksjon. Etterforskerne forventer å observere abnormiteter i tarmslimhinnen hos RO-barn, og alvorlighetsgraden av disse abnormitetene kan korrelere med nivået av MAIT-celledefekt og tilstedeværelsen av CVB-infeksjon. Etterforskerne forventer å demonstrere at MAIT-celler representerer en ny biomarkør for progresjon mot diabetes, så vel som en funksjonell immunmarkør for aggressiviteten til den autoimmune sykdommen. Som sådan kunne denne studien bestemme det nøyaktige terapeutiske vinduet for forebyggende strategier basert på MAIT-cellemanipulasjon.