Przesłuch między niezmiennymi komórkami T (MAIT) związanymi z błoną śluzową a mikroflorą i błoną śluzową jelit w rozwoju cukrzycy typu 1 u dzieci (MAIT-DT1)

Przedmioty: Wiele badań. Pacjenci będą objęci oddziałem diabetologii i endokrynologii dziecięcej szpitala dziecięcego Necker Sick oraz oddziałem pediatrycznym szpitala ANTONY.

• Niedawny początek (RO) n=40: Nowi pacjenci z początkiem zostaną włączeni wkrótce po postawieniu diagnozy.
• Kohorta zagrożona (AR) n=70: Rodzeństwo pacjentów z cukrzycą T1D, u których wcześniej uzyskano pozytywny wynik testu na obecność HLA DR3 i DR4, zostanie poproszone o wzięcie udziału w badaniu.
• Kohorta kontrolna (C) (n=50): Osobnikami kontrolnymi będą pacjenci zgłaszający się do szpitala Necker Hospital w celu przeprowadzenia badań endokrynologicznych
• Kontrola endoskopii (CE) n= 20: pacjenci konsultowani w szpitalu Necker lub szpitalu Antony w celu wykonania endoskopii UGI

Analiza:

Analiza komórek MAIT: Do analizy FACS komórki MAIT zostaną zidentyfikowane jako limfocyty T CD3+ CD4-CD161high Vα7.2+. Markery powierzchniowe zostaną przeanalizowane w celu określenia ich statusu aktywacji (CD25, CD69, CD44), ich wyczerpania (PD1, KLRG1, TIM3), ich zdolności do migracji (CCR6), a ich proliferacja i przeżycie zostaną przeanalizowane przez ekspresję Ki67 i BCL2. Produkcja cytokin zostanie oceniona po aktywacji PMA-jonomycyną, a następnie wybarwieniu wewnątrzcytoplazmatycznym przeciwciałami przeciwko IL-2, IFN-γ TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 i granzymowi B. W celu określenia zdolności komórek MAIT do odpowiedzi na stymulację TCR (wyczerpanie), stymulacja in vitro zostanie przeprowadzona w obecności specyficznych ligandów bakteryjnych. Ekspresja markera aktywacji będzie analizowana przez FACS, a cytokiny uwalniane w supernatancie przez test oparty na cytometrii.

Analiza mikroflory jelitowej: Próbki kału są pobierane i bezpośrednio przechowywane w warunkach beztlenowych. W ciągu godziny próbki są przetwarzane: jedna frakcja jest dzielona na porcje i zamrażana w temperaturze -80°C, a inna frakcja jest używana do przygotowania supernatantu kałowego do testu biologicznego ligandów MAIT, dzielona na porcje i zamrażana. Test biologiczny do pomiaru obecności ligandów komórek MAIT za pomocą testów biologicznych z użyciem linii komórkowej WT3 oraz MR117 związanego z płytką. Sekwencjonowanie 16S wszystkich próbek i zgodnie z wynikami uzyskanymi w teście biologicznym i 16S, 10 próbek zostanie wybranych do analizy metagenomicznej.

Stan zakażenia wirusem Coxsackie B (CVB): Swoiste przeciwciała przeciwko wirusowi Coxsackie B i pomiar qPCR specyficzny dla CVB w próbkach mikroflory jelitowej zostanie przeprowadzony u wszystkich pacjentów z trzech kohort, a analiza błony śluzowej jelit za pomocą q-PCR i immunochemii zostanie przeprowadzona przeprowadzone na podgrupie pacjentów.

Integralność jelita: badacze ocenią przepuszczalność jelita za pomocą testu Laktuloza-Mannitol w podpróbce grup RO, RD i AR (> 5 lat, n=20). W skrócie, po całonocnym poście, pacjenci wypijają 50 ml roztworu 5 g laktulozy i 2 g mannitolu. Mocz będzie zbierany przed i 5 godzin po spożyciu.

Analiza błony śluzowej jelita: W podgrupie pacjentów (bez celiakii, co określono na podstawie dawki przeciwciał przeciwko transglutaminazie), podczas endoskopii IUG zostaną wykonane biopsje dwunastnicy. Biopsja dwunastnicy będzie wykonywana u osób z RD w wieku powyżej 8 lat oraz u pacjentów z CE w wieku powyżej 4 lat. Biopsje te zostaną przeanalizowane metodą qPCR pod kątem ekspresji kluczowych cząsteczek nabłonkowych, takich jak fukozylotransferaza 2 (fut2), białka połączeń ścisłych (okludyna, claudin4), peptydy przeciwdrobnoustrojowe (Reg3, LL37) i składnik śluzu (mucyna 2). Funkcjonowanie komórek odpornościowych będzie również oceniane za pomocą q-PCR dla kluczowych cytokin/cząsteczek, takich jak IL-23, IL-17, IL-22, Foxp3, IL-10, TGFb i CVB.

Na podstawie wcześniejszych badań wielkość próby powinna uwzględniać różnice statystyczne między grupami AR, RO i C. Badacze spodziewają się zaobserwować nieprawidłowości komórek MAIT we krwi u pacjentów z RO i niektórych dzieci z grupy ryzyka po serokonwersji, ale przed wystąpieniem cukrzycy. Te nowe dane wzmocnią nasz model prognostyczny (patrz dane wstępne). Ponieważ komórki MAIT rozpoznają ligand bakteryjny, stawiamy hipotezę, że zmiana komórek MAIT może zachodzić równolegle ze zmianami mikroflory i / lub infekcją CVB. Badacze przewidują obserwowanie nieprawidłowości błony śluzowej jelit u dzieci RO, a nasilenie tych nieprawidłowości może korelować z poziomem defektu komórek MAIT i obecnością zakażenia CVB. Badacze spodziewają się wykazać, że komórki MAIT stanowią nowy biomarker postępu w kierunku cukrzycy, jak również funkcjonalny marker immunologiczny agresywności choroby autoimmunologicznej. W związku z tym badanie to może określić dokładne okno terapeutyczne dla strategii zapobiegawczych opartych na manipulacji komórkami MAIT.