Diafonía entre las células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT) y la microbiota intestinal y la mucosa en el desarrollo de la diabetes tipo 1 en niños (MAIT-DT1)

Sujetos: Estudio múltiple. Los sujetos se incluirán en la unidad de diabetes pediátrica y endocrinología del hospital de niños Necker Sick y en la unidad de pediatría del hospital ANTONY.

• Inicio reciente (RO) n=40: los pacientes de inicio reciente se incluirán poco después del diagnóstico.
• Cohorte en riesgo (AR) n = 70: se les pedirá que participen en el estudio a los hermanos examinados de forma rutinaria de pacientes con diabetes tipo 1 que previamente dieron positivo para HLA DR3 y DR4.
• Cohorte de control (C) (n = 50): los sujetos de control serán pacientes que consultan en el Hospital Necker para pruebas endocrinas
• Control para endoscopia (CE) n= 20: pacientes que consultan en el Hospital Necker o en el hospital Antony para endoscopia UGI

Análisis:

Análisis de células MAIT: Para el análisis FACS, las células MAIT se identificarán como células T CD3+ CD4-CD161high Vα7.2+. Se analizarán marcadores de superficie para determinar su estado de activación (CD25, CD69, CD44), su agotamiento (PD1, KLRG1, TIM3), su capacidad de migración (CCR6), y se analizará su proliferación y supervivencia por expresión de Ki67 y BCL2. La producción de citoquinas se evaluará después de la activación de PMA-ionomicina, seguida de tinción intracitoplasmática con anticuerpos contra IL-2, IFN-γ TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 y granzima B. Para determinar la capacidad de respuesta de las células MAIT a la estimulación con TCR (agotamiento), se realizará una estimulación in vitro en presencia de ligandos bacterianos específicos. La expresión del marcador de activación se analizará mediante FACS y las citoquinas liberadas en el sobrenadante mediante un ensayo basado en citometría.

Análisis de microbiota intestinal: Las muestras de heces se recolectan y se mantienen directamente en condiciones anaeróbicas. En una hora, las muestras se procesan: una fracción se divide en alícuotas y se congela a -80 °C y otra fracción se usa para preparar el sobrenadante fecal para el bioensayo de los ligandos MAIT, se divide en alícuotas y se congela. Bioensayo para medir la presencia de ligandos de células MAIT mediante bioensayos utilizando la línea celular WT3 así como MR117 unido a la placa. Secuenciación 16S de todas las muestras y de acuerdo a los resultados obtenidos con el bioensayo y 16S, se seleccionarán 10 muestras para análisis metagenómico.

Estado de infección por el virus Coxsackie B (CVB): se realizarán anticuerpos específicos contra el virus Coxsackie B y QPCR específico de CVB en muestras de microbiota intestinal en todos los pacientes de las tres cohortes, y se realizará un análisis de la mucosa intestinal mediante q-PCR e inmunoquímica. realizado en un subconjunto de pacientes.

Integridad intestinal: los investigadores evaluarán la permeabilidad del intestino mediante la prueba de lactulosa-manitol en una submuestra de los grupos RO, RD y AR (> 5 años de edad, n = 20). En resumen, después de un ayuno nocturno, los pacientes beberán 50 ml de solución de 5 g de lactulosa y 2 g de manitol. La orina se recogerá antes y 5 horas después de la ingestión.

Análisis de la mucosa intestinal: en un subgrupo de pacientes (sin enfermedad celíaca según lo determinado por la dosis de anticuerpos contra la transglutaminasa), se obtendrán biopsias duodenales durante una endoscopia IUG. La biopsia duodenal se realizará en sujetos RD mayores de 8 años y en sujetos CE mayores de 4 años. Estas biopsias se analizarán mediante qPCR para determinar la expresión de moléculas epiteliales clave, como la fucosil transferasa 2 (fut2), las proteínas de unión estrecha (occludina, claudina4), los péptidos antimicrobianos (Reg3, LL37) y el componente mucoso (mucina 2). La función de las células inmunitarias también se evaluará mediante q-PCR para citoquinas/moléculas clave como IL-23, IL-17, IL-22, Foxp3, IL-10, TGFb y CVB.

Con base en estudios previos, el tamaño de la muestra debería permitir diferencias estadísticas entre los grupos AR, RO y C. Los investigadores anticipan observar anomalías en las células MAIT de la sangre en pacientes con ósmosis inversa y algunos niños en riesgo después de la seroconversión pero antes del inicio de la diabetes. Estos nuevos datos reforzarán nuestro modelo predictivo (ver datos preliminares). Dado que las células MAIT reconocen el ligando bacteriano, planteamos la hipótesis de que la alteración de las células MAIT podría ocurrir en paralelo con cambios en la microbiota y/o infección CVB. Los investigadores prevén observar anomalías de la mucosa intestinal en niños con RO y la gravedad de estas anomalías puede correlacionarse con el nivel de defecto de las células MAIT y la presencia de infección CVB. Los investigadores esperan demostrar que las células MAIT representan un nuevo biomarcador de progresión hacia la diabetes, así como un marcador inmunológico funcional de la agresividad de la enfermedad autoinmune. Como tal, este estudio podría determinar la ventana terapéutica precisa para estrategias preventivas basadas en la manipulación de células MAIT.