Limakalvoon liittyvien invarianttien T-solujen (MAIT) ja suoliston mikrobiston ja limakalvon ylikuuluminen tyypin 1 diabeteksen kehittymisessä lapsilla (MAIT-DT1)

Aiheet: Monitutkimus. Koehenkilöt otetaan mukaan Necker Sickin lastensairaalan lasten diabeteksen ja endokrinologian osastolle ja ANTONY-sairaalan lastenosastolle.

• Äskettäin alkanut (RO) n = 40: Uudet potilaat otetaan mukaan pian diagnoosin jälkeen.
• Riskikohortti (AR) n = 70: Rutiininomaisesti seulottuja T1D-potilaiden sisaruksia, joiden aiemmin HLA DR3- ja DR4-testi on positiivinen, pyydetään osallistumaan tutkimukseen.
• Kontrolli (C) kohortti (n = 50): Kontrollihenkilöt ovat potilaita, jotka konsultoivat Neckerin sairaalassa endokriinisen testauksen tekemiseksi.
• Endoskopian kontrolli (CE) n = 20: potilaat neuvottelevat Neckerin sairaalassa tai Antonyn sairaalassa UGI-endoskopiaa varten

Analyysi:

MAIT-soluanalyysi: FACS-analyysiä varten MAIT-solut tunnistetaan CD3+ CD4-CD161high Vα7.2+ T-soluiksi. Pintamarkkereita analysoidaan niiden aktivaatiotilan (CD25, CD69, CD44), uupumuksen (PD1, KLRG1, TIM3), migraatiokapasiteetin (CCR6) sekä niiden lisääntymisen ja eloonjäämisen määrittämiseksi Ki67- ja BCL2-ekspressiolla. Sytokiinituotanto arvioidaan PMA-ionomysiiniaktivaation jälkeen, mitä seuraa intrasytoplasminen värjäys vasta-aineilla IL-2:ta, IFN-y TNF-a:ta, IL-2:ta, IL-4:ää, IL-10:tä, IL-13:a, IL-17:ää ja grantsyymiä vastaan. B. Määrittääksesi MAIT-solujen kyvyn vastata TCR-stimulaatioon (uupumus), suoritetaan in vitro -stimulaatio spesifisten bakteeriligandien läsnä ollessa. Aktivointimarkkerin ilmentyminen analysoidaan FACS:llä ja supernatantissa vapautuneet sytokiinit sytometripohjaisella määrityksellä.

Suoliston mikrobiotaanalyysi: Ulostenäytteet kerätään ja pidetään suoraan anaerobisissa olosuhteissa. Näytteet käsitellään tunnin sisällä: yksi fraktio jaetaan eriin ja jäädytetään -80 °C:ssa ja toista fraktiota käytetään ulosteen supernatantin valmistukseen MAIT-ligandien biotestiä varten, jaetaan eriin ja pakastetaan. Biomääritys MAIT-soluligandien läsnäolon mittaamiseksi biomäärityksillä käyttämällä WT3-solulinjaa sekä levyyn sidottua MR117:ää. Kaikkien näytteiden 16S-sekvensointi ja biotestillä ja 16S:llä saatujen tulosten mukaan 10 näytettä valitaan metagenomiseen analyysiin.

Coxsackie-virus B (CVB) -infektion tila: Coxsackie-viruksen B- ja CVB-spesifiset qPCR-mittaukset suoliston mikrobiotanäytteissä suoritetaan kaikille kolmen kohortin potilaille, ja suoliston limakalvon analyysi q-PCR:llä ja immunokemialla. suoritettu osalle potilaita.

Suolen eheys: tutkijat arvioivat suolen läpäisevyyden käyttämällä laktuloosi-mannitolitestiä RO-, RD- ja AR-ryhmien alanäytteessä (> 5-vuotiaat, n = 20). Lyhyesti sanottuna potilaat juovat yön yli paaston jälkeen 50 ml liuosta, jossa on 5 g laktuloosia ja 2 g mannitolia. Virtsa kerätään ennen ja 5 tuntia sen jälkeen.

Suolen limakalvoanalyysi: Osalle potilaista (ei keliakiaa transglutaminaasivasta-aineiden annostuksen perusteella määritettynä) pohjukaissuolesta otetaan biopsia IUG-endoskopian aikana. Pohjukaissuolen biopsia tehdään yli 8-vuotiaille RD-potilaille ja yli 4-vuotiaille CE-potilaille. Nämä biopsiat analysoidaan qPCR:llä tärkeimpien epiteelimolekyylien, kuten fukosyylitransferaasi 2:n (fut2), tiiviin liitoksen proteiinien (okkludiini, claudiini4), antimikrobisten peptidien (Reg3, LL37) ja limakomponentin (musiini 2) ilmentymisen suhteen. Immuunisolujen toiminta arvioidaan myös q-PCR:llä avainsytokiineille/molekyyleille, kuten IL-23, IL-17, IL-22, Foxp3, IL-10, TGFb ja CVB.

Aiemman tutkimuksen perusteella otoskoon tulisi sallia tilastolliset erot AR-, RO- ja C-ryhmien välillä. Tutkijat odottavat havaitsevansa veren MAIT-solujen poikkeavuuksia RO-potilailla ja joillakin riskilapsilla serokonversion jälkeen, mutta ennen diabeteksen puhkeamista. Nämä uudet tiedot vahvistavat ennustemalliamme (katso alustavat tiedot). Koska MAIT-solut tunnistavat bakteeriligandin, oletamme, että MAIT-solujen muutos voi tapahtua samanaikaisesti mikrobiotan muutosten ja/tai CVB-infektion kanssa. Tutkijat odottavat havainnoivansa suolen limakalvon poikkeavuuksia RO-lapsilla, ja näiden poikkeavuuksien vakavuus saattaa korreloida MAIT-soluvaurioiden tason ja CVB-infektion esiintymisen kanssa. Tutkijat odottavat osoittavansa, että MAIT-solut edustavat uutta diabeteksen etenemisen biomarkkeria sekä toiminnallista immuunimerkkiainetta autoimmuunisairauden aggressiivisuudesta. Sellaisenaan tämä tutkimus voisi määrittää tarkan terapeuttisen ikkunan ennaltaehkäiseville strategioille, jotka perustuvat MAIT-solujen manipulointiin.