Přeslechy mezi invariantními T buňkami spojenými se sliznicí (MAIT) a střevní mikrobiotou a sliznicí ve vývoji diabetu 1. typu u dětí (MAIT-DT1)

Předměty: Multistudium. Subjekty budou zařazeny na dětské diabetologické a endokrinologické oddělení v dětské nemocnici Necker Sick a na dětském oddělení nemocnice ANTONY.

• Recent-onset (RO) n=40: Noví pacienti budou zařazeni krátce po diagnóze.
• Riziková (AR) kohorta n=70: Rutinně vyšetřovaní sourozenci pacientů s T1D, kteří byli dříve pozitivně testováni na HLA DR3 a DR4, budou požádáni, aby byli součástí studie.
• Kontrolní (C) kohorta (n=50): Kontrolními subjekty budou pacienti konzultující v Neckerově nemocnici endokrinní testy
• Kontrola pro endoskopii (CE) n= 20: pacienti konzultující endoskopii UGI v nemocnici Necker Hospital nebo v nemocnici Antony

Analýza:

Analýza buněk MAIT: Pro analýzu FACS budou buňky MAIT identifikovány jako CD3+ CD4-CD161high Vα7.2+ T buňky. Povrchové markery budou analyzovány za účelem stanovení jejich aktivačního stavu (CD25, CD69, CD44), jejich vyčerpání (PD1, KLRG1, TIM3), jejich migrační kapacity (CCR6) a jejich proliferace a přežití pomocí exprese Ki67 a BCL2. Produkce cytokinů bude hodnocena po aktivaci PMA-ionomycinu, po které bude následovat intracytoplazmatické barvení protilátkami proti IL-2, IFN-γ TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 a granzymu B. Ke stanovení kapacity buněk MAIT reagovat na stimulaci TCR (vyčerpání) bude provedena stimulace in vitro v přítomnosti specifických bakteriálních ligandů. Exprese aktivačního markeru bude analyzována pomocí FACS a cytokiny uvolněné v supernatantu pomocí testu založeného na cytometrii.

Analýza střevní mikroflóry: Vzorky stolice se odebírají a přímo udržují v anaerobních podmínkách. Během hodiny se vzorky zpracují: jedna frakce se rozdělí na alikvoty a zmrazí na -80 °C a další frakce se použije k přípravě fekálního supernatantu pro biotest MAIT ligandů, rozdělí se na alikvoty a zmrazí. Biotest pro měření přítomnosti MAIT buněčných ligandů pomocí biologických testů s použitím buněčné linie WT3 a také MR117 vázaného na destičku. 16S sekvenování všech vzorků a podle výsledků získaných biotestem a 16S bude vybráno 10 vzorků pro metagenomickou analýzu.

Stav infekce virem Coxsackie B (CVB): U všech pacientů ze tří kohort bude provedeno měření specifických protilátek proti viru coxsackie B a CVB specific-qPCR ve vzorcích střevní mikroflóry a analýza střevní sliznice pomocí q-PCR a imunochemie. prováděny na podskupině pacientů.

Integrita střeva: vyšetřovatelé posoudí propustnost střeva pomocí testu laktulóza-mannitol na dílčím vzorku skupin RO, RD a AR (> 5 let věku, n=20). Krátce po celonočním hladovění pacienti vypijí 50 ml roztoku 5 g laktulózy a 2 g mannitolu. Moč bude odebírána před a 5 hodin po požití.

Analýza střevní sliznice: U podskupiny pacientů (bez celiakie, jak je stanoveno dávkováním protilátek proti transglutamináze) budou během IUG endoskopie získány biopsie duodena. Duodenální biopsie bude provedena u pacientů s RD starších 8 let au CE subjektů starších než 4 roky. Tyto biopsie budou analyzovány pomocí qPCR na expresi klíčových epiteliálních molekul, jako je fukosyltransferáza 2 (fut2), proteiny s úzkým spojením (okludin, claudin4), antimikrobiální peptidy (Reg3, LL37) a složka hlenu (mucin 2). Funkce imunitních buněk bude také hodnocena pomocí q-PCR pro klíčové cytokiny/molekuly, jako jsou IL-23, IL-17, IL-22, Foxp3, IL-10, TGFb a CVB.

Na základě předchozí studie by velikost vzorku měla umožnit statistické rozdíly mezi skupinami AR, RO a C. Vyšetřovatelé očekávají, že budou pozorovat abnormality krevních buněk MAIT u pacientů s RO a některých rizikových dětí po sérokonverzi, ale před nástupem diabetu. Tato nová data posílí náš prediktivní model (viz předběžná data). Protože buňky MAIT rozpoznávají bakteriální ligand, předpokládáme, že ke změnám buněk MAIT může dojít paralelně se změnami mikroflóry a/nebo infekcí CVB. Vyšetřovatelé předpokládají pozorování abnormalit střevní sliznice u dětí s RO a závažnost těchto abnormalit může korelovat s úrovní defektu buněk MAIT a přítomností infekce CVB. Výzkumníci očekávají, že prokážou, že buňky MAIT představují nový biomarker progrese směrem k diabetu a také funkční imunitní marker agresivity autoimunitního onemocnění. Jako taková by tato studie mohla určit přesné terapeutické okno pro preventivní strategie založené na manipulaci s buňkami MAIT.