Взаимосвязь между ассоциированными со слизистой оболочкой инвариантными Т-клетками (MAIT) и микробиотой кишечника и слизистой оболочкой при развитии диабета 1 типа у детей (MAIT-DT1)

Предметы: Многопрофильное исследование. Субъекты будут включены в педиатрическое отделение диабета и эндокринологии детской больницы Necker Sick и в педиатрическое отделение больницы ANTONY.

• Недавнее начало (RO) n = 40: новые пациенты с началом заболевания будут включены вскоре после постановки диагноза.
• Когорта группы риска (AR) n = 70: Братья и сестры пациентов с СД1, которые проходят регулярный скрининг и ранее дали положительный результат на HLA DR3 и DR4, будут приглашены для участия в исследовании.
• Контрольная (C) когорта (n = 50): контрольными субъектами будут пациенты, консультирующиеся в больнице Некера для эндокринного тестирования.
• Контроль эндоскопии (CE) n = 20: пациенты, консультирующиеся в больнице Necker или в больнице Antony для эндоскопии UGI

Анализ:

Анализ клеток MAIT: для анализа FACS клетки MAIT будут идентифицированы как Т-клетки CD3+ CD4-CD161high Vα7.2+. Поверхностные маркеры будут проанализированы для определения их статуса активации (CD25, CD69, CD44), их истощения (PD1, KLRG1, TIM3), их способности к миграции (CCR6), а их пролиферация и выживаемость будут проанализированы с помощью экспрессии Ki67 и BCL2. Продукцию цитокинов будут оценивать после активации PMA-иономицином с последующим внутрицитоплазматическим окрашиванием антителами против IL-2, IFN-γ TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 и гранзима. B. Для определения способности клеток MAIT реагировать на стимуляцию TCR (истощение) будет проводиться стимуляция in vitro в присутствии специфических бактериальных лигандов. Экспрессию маркера активации анализируют с помощью FACS, а цитокины, высвобождаемые в супернатант, анализируют на основе цитометрии.

Анализ микробиоты кишечника: образцы стула собираются и хранятся непосредственно в анаэробных условиях. В течение часа образцы обрабатывают: одну фракцию делят на аликвоты и замораживают при -80°С, а другую фракцию используют для приготовления фекального супернатанта для биоанализа лигандов MAIT, делят на аликвоты и замораживают. Биоанализ для измерения присутствия клеточных лигандов MAIT с помощью биоанализа с использованием клеточной линии WT3, а также связанного с планшетом MR117. 16S-секвенирование всех образцов и по результатам, полученным с помощью биоанализа и 16S, 10 образцов будут отобраны для метагеномного анализа.

Инфицирование вирусом Коксаки B (CVB): специфические антитела против вируса Коксаки B и определение CVB-специфической количественной ПЦР в образцах кишечной микробиоты будут выполняться у всех пациентов из трех когорт, а анализ слизистой оболочки кишечника с помощью количественной ПЦР и иммунохимии будет проводится на подгруппе пациентов.

Целостность кишечника: исследователи будут оценивать проницаемость кишечника с помощью теста лактулоза-маннитол в подвыборке групп RO, RD и AR (> 5 лет, n = 20). Короче говоря, после ночного голодания пациенты выпивают 50 мл раствора 5 г лактулозы и 2 г маннитола. Моча будет собираться до и через 5 часов после приема пищи.

Анализ слизистой оболочки кишечника: у части пациентов (без глютеновой болезни, что определяется дозой антител против трансглютаминазы) биопсия двенадцатиперстной кишки будет получена во время эндоскопии IUG. Биопсия двенадцатиперстной кишки будет проводиться у пациентов с РЗ старше 8 лет и у пациентов с ХЭ старше 4 лет. Эти биоптаты будут проанализированы с помощью количественной ПЦР на экспрессию ключевых эпителиальных молекул, таких как фукозилтрансфераза 2 (fut2), белки плотных контактов (окклюдин, клаудин4), антимикробные пептиды (Reg3, LL37) и компонент слизи (муцин 2). Функцию иммунных клеток также будут оценивать с помощью q-PCR для ключевых цитокинов/молекул, таких как IL-23, IL-17, IL-22, Foxp3, IL-10, TGFb и CVB.

На основании предыдущего исследования размер выборки должен допускать статистические различия между группами AR, RO и C. Исследователи предполагают наблюдать аномалии клеток MAIT в крови у пациентов с RO и у некоторых детей из группы риска после сероконверсии, но до начала диабета. Эти новые данные укрепят нашу прогностическую модель (см. предварительные данные). Поскольку клетки MAIT распознают бактериальный лиганд, мы предполагаем, что изменение клеток MAIT может происходить параллельно с изменениями микробиоты и/или CVB-инфекцией. Исследователи ожидают наблюдения аномалий слизистой оболочки кишечника у детей с RO, и тяжесть этих аномалий может коррелировать с уровнем дефекта клеток MAIT и наличием CVB-инфекции. Исследователи надеются продемонстрировать, что клетки MAIT представляют собой новый биомаркер прогрессирования диабета, а также функциональный иммунный маркер агрессивности аутоиммунного заболевания. Таким образом, это исследование может определить точное терапевтическое окно для профилактических стратегий, основанных на манипуляциях с клетками MAIT.