Krydstale mellem mucosal-associerede invariante T-celler (MAIT) og tarmmikrobiota og slimhinde i udviklingen af ​​type 1-diabetes hos børn (MAIT-DT1)

Fag: Multistudie. Forsøgspersoner vil blive inkluderet i den pædiatriske diabetes- og endokrinologiske enhed på Necker Syge børnehospitalet og i den pædiatriske enhed på ANTONY hospitalet.

• Recent-debut (RO) n=40: Nye debuterende patienter vil blive inkluderet kort efter diagnosen.
• Risikokohorte (AR) n=70: Rutinemæssigt screenede søskende til T1D-patienter, der tidligere er testet positive for HLA DR3 og DR4, vil blive bedt om at være en del af undersøgelsen.
• Kontrol (C) kohorte (n=50): Kontrolpersoner vil være patienter, der konsulteres på Necker Hospital med henblik på endokrin testning
• Kontrol for endoskopi (CE) n= 20: patienter, der konsulterer på Necker Hospital eller på Antony hospital for UGI endoskopi

Analyse:

MAIT-celleanalyse: Til FACS-analyse vil MAIT-celler blive identificeret som CD3+ CD4-CD161high Vα7.2+ T-celler. Overflademarkører vil blive analyseret for at bestemme deres aktiveringsstatus (CD25, CD69, CD44), deres udmattelse (PD1, KLRG1, TIM3), deres migrationskapacitet (CCR6) og deres proliferation og overlevelse vil blive analyseret ved Ki67 og BCL2 ekspression. Cytokinproduktion vil blive vurderet efter PMA-ionomycin-aktivering, efterfulgt af intracytoplasmatisk farvning med antistoffer mod IL-2, IFN-γ TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 og granzym B. For at bestemme MAIT-cellernes kapacitet til at reagere på TCR-stimulering (udmattelse), vil in vitro-stimulering blive udført i nærvær af specifikke bakterielle ligander. Aktiveringsmarkørekspression vil blive analyseret af FACS og cytokiner frigivet i supernatanten ved cytometribaseret assay.

Tarmmikrobiotaanalyse: Afføringsprøver indsamles og holdes direkte under anaerobe tilstand. Inden for en time behandles prøverne: en fraktion uddeles i alikvoter og nedfryses ved -80°C, og en anden fraktion anvendes til at fremstille fækal supernatant til bioassay af MAIT-ligander, fordelt i portioner og frosset. Bioassay til måling af tilstedeværelsen af ​​MAIT-celleligander ved bioassays ved brug af WT3-cellelinje samt pladebundet MR117. 16S-sekventering af alle prøver og i henhold til resultaterne opnået med bioassayet og 16S, vil 10 prøver blive udvalgt til metagenomisk analyse.

Coxsackie virus B (CVB) infektionsstatus: Specifikke antistoffer mod coxsackie virus B og CVB specifik qPCR måling i tarmmikrobiota prøver vil blive udført i alle patienter i de tre kohorter, og analyse af tarmslimhinden ved q-PCR og immunkemi vil blive udført. udført på en undergruppe af patienter.

Tarmintegritet: Efterforskerne vil vurdere tarmens permeabilitet ved hjælp af Lactulose-Mannitol-testen i en underprøve af RO-, RD- og AR-grupper (> 5 år, n=20). Kort fortalt vil patienterne efter faste natten over drikke 50 ml opløsning af 5 g lactulose og 2 g mannitol. Urin vil blive opsamlet før og 5 timer efter indtagelse.

Tarmslimhindeanalyse: Hos en undergruppe af patienter (uden cøliaki som bestemt af doseringen af ​​antistoffer mod transglutaminase) vil duodenale biopsier blive udtaget under en IUG-endoskopi. Duodenal biopsi vil blive udført hos RD-personer ældre end 8 år og hos CE-personer ældre end 4 år. Disse biopsier vil blive analyseret med qPCR for ekspression af nøgleepitelmolekyler såsom fucosyltransferase 2 (fut2), tight junction proteiner (occludin, claudin4), antimikrobielle peptider (Reg3, LL37) og slimkomponent (mucin 2). Immuncellers funktion vil også blive vurderet ved q-PCR for nøglecytokiner/molekyler såsom IL-23, IL-17, IL-22, Foxp3, IL-10, TGFb og CVB.

Baseret på tidligere undersøgelse bør stikprøvestørrelsen tillade statistiske forskelle mellem AR-, RO- og C-grupper. Forskerne forventer at observere blod-MAIT-celleabnormiteter hos RO-patienter og nogle risikobørn efter serokonversion, men før diabetes debut. Disse nye data vil styrke vores prædiktive model (se foreløbige data). Da MAIT-celler genkender bakteriel ligand, antager vi, at MAIT-celleændring kan forekomme parallelt med mikrobiotaændringer og/eller CVB-infektion. Forskerne forventer at observere abnormiteter i tarmslimhinden hos RO-børn, og sværhedsgraden af ​​disse abnormiteter kan korrelere med niveauet af MAIT-celledefekt og tilstedeværelsen af ​​CVB-infektion. Forskerne forventer at påvise, at MAIT-celler repræsenterer en ny biomarkør for progression mod diabetes såvel som en funktionel immunmarkør for den autoimmune sygdoms aggressivitet. Som sådan kunne denne undersøgelse bestemme det nøjagtige terapeutiske vindue for forebyggende strategier baseret på MAIT-cellemanipulation.