CAI とビリルビンの相関関係を分析する縦断的研究

新生児の場合、血管内溶血は、赤血球の生理的代謝回転の一部としての軽度のものから、黄疸や ABO 不適合などの重篤なものまでさまざまです。 溶血の初期のバイオマーカーは、特にアッセイが単純、迅速、非侵襲的かつ定量的である場合、リスクのある患者を特定することにより、新生児学の実践を改善します。 満期産の男児を対象とした現在完了している URICA 試験 (試験登録 CPMS 19576) では、赤血球に豊富に見られる小さな細胞質タンパク質炭酸脱水酵素 I (CAI) が (イムノアッセイおよび質量分析によって) 検出されたことが示されました。新生児病棟で募集された赤ちゃんごとに1回収集された26個の尿サンプルのうち17個。 CAI 陽性サンプルは、ビリルビンのレベルが急速に上昇しているか、光線療法の閾値を超えてピークに達している乳児から得られました。 CAI 陰性の尿は、ビリルビンが光線療法の閾値に達しなかった場合、またはビリルビンがピークから回復した後に得られました。 4 回、CAI 陽性の尿の原因は不明でした (https://doi.org/10.1093/jalm/jfaa051)。 CAI は通常尿中に存在しないため、陽性シグナルは血管内溶血を示し、CAI が糸球体関門を通過したことを確認します。 ただし、差し迫った溶血性クリーゼを予測および推定するための尿中 CAI の定量的能力には、URICA-II 試験の目的である新しい縦断的研究が必要です。

臨床的根拠: 急速に進行し、生命を脅かす可能性のある多くの血管内溶血を伴う状態の 1 つについて、新生児の健康状態を定期的に監視する必要があります。 これらには敗血症が含まれます (例: グラム陽性菌）、原虫感染（例： マラリア)、同種免疫 (ABO とアカゲザルの不和合性)、遺伝的形質 (例: 鎌状赤血球症、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ [G6PD] 欠損症)、または電解質の不均衡。 これらの条件の一部 (例: RhD、G6PD、鎌状形質) は、少数民族グループで特に一般的です [1-4]。 高度な医療施設では、溶血の検査には、顕微鏡分析用の血液サンプルの採取が含まれます (例: 細胞数および形態）または生化学的アッセイ（非抱合型ビリルビンまたは乳酸脱水素酵素など）。 クームス試験による自己免疫性溶血性貧血やレドックスアッセイによるG6PD欠乏症など、溶血の特定の原因を診断するために、他のリソース集約的な試験が利用可能です。 これらのテストには、訓練を受けた人員、高度な実験装置、および高い衛生基準が必要です。 ポイントオブケアの最小限の実験室条件に適応した、疾患の新しいバイオマーカーに関するよりシンプルで安価で高速なテストは、医学的および経済的に正当化されます。 この技術は、溶血がより一般的になる発展途上国にも利益をもたらすでしょう。

科学的背景: 可溶性酵素炭酸脱水酵素 I (CAI) は、ヘモグロビン アイソフォームに次いで、赤血球の細胞質で最も豊富なタンパク質です [5]。 血漿には通常微量の CAI しか含まれていませんが、溶血するとレベルが上昇します [6]。 その小さいサイズ (29 kDa およびストークス半径 25 Å [7-9]) に基づいて、CAI は糸球体関門を横切ってろ過され、尿中に現れると予測されます [10]。 定量的免疫技術は、1:10,000 希釈でも CAI を検出できます。 健康な成人の尿には通常 CAI がなく、バックグラウンド信号が非常に低くなります。 尿中 CAI 排泄は溶血の程度に比例すると予想されるため、非侵襲的にアッセイできる定量的バイオマーカーとして機能します。

(最初の) URICA 試験の目的: 現在完了している URICA 試験 (炭酸脱水酵素の尿中排泄; 試験登録 CPMS 19576) の目的は、Evelina's Children に入院した正期産新生児の尿中の CA アイソフォームの存在をテストすることでした。病院。 コホートには、溶血（軽度の生理学的形態を超える）が疑われないコントロールと、ABO不適合、貧血、および黄疸の治療を受けている赤ちゃんが含まれていました。 URICA 試験は、2015 年 5 月 12 日に倫理的承認を得ました (REC: 15/NS/0042)。 サンプルの収集と分析は、2017 年 6 月までに完了しました。 尿の測定は、CAI のウェスタンブロッティング (高感度だが半定量的な方法)、CAI の ELISA (CAI レベルを決定するための定量的方法)、尿のプロテオームを得るための質量分析、および総タンパク質とクレアチニンの測定 (除外基準として腎不全の証拠を評価するため)。 さらに、可能であれば、妊娠、血中ヘモグロビン、血清または経皮ビリルビン、およびC反応性タンパク質に関する臨床データをいくつかの時点で収集し、貧血、黄疸、および感染症をそれぞれテストしました。 26人の赤ちゃんが募集されました。

URICA 試験の結果: ウェスタンブロッティングでは、9 つ​​のサンプルで CAI シグナルが検出されず (成体尿のバックグラウンドシグナルと区別がつかない)、17 のサンプルで一定範囲の陽性シグナルが示されました。 これらの結果は、ELISA 測定によってサポートされました。 2 つのサンプルではタンパク質/クレアチニン レベルが上昇しており、おそらく腎障害を示していますが、これらは CAI 陽性の尿を生成しませんでした。 マススペクトル分析は、CAIレベルが他の赤血球タンパク質と相関しないことを示し、溶血が尿路ではなく血管内で発生したことを強く示しています（尿路などからの信号にもつながる場所）。 ヘモグロビンまたは陰イオン交換体 1)。 CAI 陰性の尿と比較した場合、CAI 陽性のサンプルで最も過剰に存在するタンパク質は、実際には CAI であり、このバイオマーカーの優れた分解能を主張しています。 尿が採取された時点を考慮すると、ビリルビン測定値に対する CAI シグナルを次のように説明できます。

• サブスレッショルド ビリルビン レベル (光線療法に関する NHS ガイドライン) の 6 人の赤ちゃんは、CAI 陰性の尿を生成しました。
• ビリルビン値が急速かつ有意に上昇している 16 人の赤ちゃん (うち 14 人は光線療法を受けた) では、CAI シグナルは、ビリルビンのピークに近いところで収集された尿サンプルで最も強く、CAI のスパイクがビリルビンのピークに先行することを示唆する傾向がありました。
• 4 人の乳児は、非常に強い CAI シグナルを伴う尿を生成しましたが、ビリルビンの上昇は示さず、明確なメカニズムが溶血を引き起こしていると主張しました。

仮説: 尿中の CAI は溶血のバイオマーカーであると提案し、以下の仮説を立てます。

1. 尿中の CAI 信号は、基礎となる溶血状態に関連するように階層化できます。

   • 検出不能: 溶血の証拠がないことを示します。
   • 中間：黄疸のある赤ちゃんの溶血を示すレベル。
   • より高い閾値：ビリルビンの上昇を引き起こさない可能性のある急性の溶血性クリーゼを示します。
2. 中程度の範囲では、陽性の尿中 CAI 信号がビリルビンのピークに先行し、黄疸の早期指標となります。

5 試験の目的と目的

ビリルビンの経時変化は現在、新生児の健康状態を測定するために使用されていますが、尿中 CAI モニタリングは、リスクのある患者を特定するための早期警告サインを提供し、新生児病棟がリソースをより適切に合理化できるようにすることを提案します。 このバイオマーカーの有用性を確立するために、満期産児のコホートで縦断研究を行い、尿中CAIの時間経過をビリルビンと相関させ(仮説2を検証するため)、原因を特定できる臨床情報を取得することを提案します。および溶血の程度 (仮説 1 のしきい値レベルを通知するため)。

研究計画: セント トーマスでは、年間 9,000 人の出産があります。 これらのうち、毎年約 1000 人の赤ちゃんが新生児集中治療室 (NICU) に入院しています。これらの赤ちゃんの約半分は正期産です。 約 300 人に光線療法が必要な黄疸があり、約 10 ～ 20 人に重度の溶血 (通常 ABO 不適合) があります。 目的は、24 か月を超えない期間にわたって 30 人の満期産児を募集することです。これらの赤ちゃんは、新生児ユニットに少なくとも 5 日間、最大 10 日間滞在し、その間、尿サンプルをできるだけ定期的に採取する予定です。 (1 日 1 回。それが不可能な場合は、少なくとも 2 日に 1 回)、タイムスタンプが付けられ、募集が完了すると、オックスフォードのオフライン分析用に専用の冷凍庫に保存されます。 採取地点の近くで実行できる場合は、少量の尿 (4 滴以下) をキットの一部として提供されるラテラル フロー デバイス (LFD) にピペットで移し、CAI 免疫反応性を瞬時に読み取ります。 . LFD は一致する尿識別子でラベル付けされ、記録されます (陽性/陰性/ボイド)。 収集ポイントの近くで実行できない場合、この手順は後でオックスフォードで解凍されたサンプルに対して実行されます。 尿サンプルから 6 時間以内に、非侵襲的な経皮ビリルビン レベルが取得され、記録されます。 これらのデータは、試験の目的とは関係のない通常の臨床診療の一環として得られた以下の情報で補完されます。

• 定期的に収集された血清ビリルビン
• 血中ヘモグロビンと全血球数
• C反応性タンパク質（CRP）と腎機能
• 妊娠期間;
• 光線療法の期間とタイミング
• 出生時体重
• セックス
• 直接クームス試験の結果。
• NICUに入院した理由。

尿サンプルは、オックスフォードで次の観点から分析されます。

• 高感度の半定量的方法であるウエスタンブロットでのCAI免疫反応性。
• 定量的方法であるELISAによるCAI免疫反応性。
• 腎臓損傷のマーカーとしての総タンパク質とクレアチニン;
• 浸透圧、利尿状態を決定します。 すべてのサンプルは英数字コードで匿名化され、臨床データにリンクされます。 4 つ未満の尿サンプルが得られた赤ちゃんは、そのようなデータセットには仮説を検証するための解決力がないという理由で、研究から除外されます。 募集は、少なくとも 4 つのサンプルを持つ 30 人の赤ちゃんが募集された時点で完了します。 染色体異常のある赤ちゃんも研究から除外されます。