En longitudinell studie for å analysere sammenhengen mellom CAI og bilirubin

Hos nyfødte kan intravaskulær hemolyse variere fra mild, som en del av den fysiologiske omsetningen av røde blodlegemer, til alvorlig i tilfeller som gulsott eller ABO-inkompatibilitet. Tidlige biomarkører for hemolyse ville forbedre neonatologisk praksis ved å identifisere risikopasienter, spesielt hvis analysen er enkel, rask, ikke-invasiv og kvantitativ. Vår nå fullførte URICA-studie på fullbårne mannlige babyer (forsøksregistrering CPMS 19576) viste at det lille cytoplasmatiske proteinet karbonsyreanhydrase I (CAI), som finnes rikelig i røde blodlegemer, ble påvist (ved immunanalyse og massespesifikasjoner), i 17 av 26 urinprøver tatt én gang per rekruttert baby ved neonatologisk avdeling. CAI-positive prøver ble tatt fra babyer med nivåer av bilirubin som raskt øker eller topper over terskelen for fototerapi. CAI-negativ urin ble oppnådd når enten bilirubin ikke nådde fototerapiterskel, eller etter at det hadde kommet seg etter toppen. Ved fire anledninger var årsaken til CAI-positiv urin ikke fastslått (https://doi.org/10.1093/jalm/jfaa051). Siden CAI normalt er fraværende i urin, er et positivt signal indikasjon på intravaskulær hemolyse og bekrefter at CAI krysset den glomerulære barrieren. Imidlertid krever den kvantitative kraften til urin-CAI til å forutsi og estimere en forestående hemolytisk krise en ny longitudinell studie, som er målet med URICA-II-studien.

Klinisk begrunnelse: Helsen til nyfødte må overvåkes regelmessig for en av mange raskt utviklende og potensielt livstruende tilstander som impliserer intravaskulær hemolyse. Disse inkluderer sepsis (f.eks. Gram-positive bakterier), protozoinfeksjon (f.eks. malaria), alloimmunitet (ABO og Rhesus inkompatibilitet), genetiske egenskaper (f.eks. sigdcelle, glukose-6-fosfat dehydrogenase [G6PD] mangel) eller elektrolytt ubalanse. Noen av disse forholdene (f.eks. RhD, G6PD, sigdtrekk) er spesielt utbredt i etniske minoritetsgrupper [1-4]. I avanserte helseinstitusjoner involverer tester for hemolyse å ta blodprøver for mikroskopianalyser (f. celletall og morfologi) eller biokjemiske analyser (f.eks. for ukonjugert bilirubin eller laktatdehydrogenase). Andre ressurskrevende tester er tilgjengelige for å diagnostisere spesifikke årsaker til hemolyse, for eksempel autoimmun hemolytisk anemi med Coombs-test eller G6PD-mangel ved redoksanalyser. Disse testene krever opplært personell, avansert laboratorieutstyr og høye standarder for hygiene. Enklere, billigere og raskere tester på nye biomarkører for sykdom, tilpasset behandlingspunkt, minimale laboratorieforhold, ville være medisinsk og økonomisk berettiget. Denne teknologien vil også være til fordel for utviklingsland, hvor hemolyse kan være mer vanlig.

Vitenskapelig bakgrunn: Det løselige enzymet karbonsyreanhydrase I (CAI) er, etter hemoglobinisoformer, det proteinet som finnes mest i cytoplasmaet til røde blodceller [5]. Plasma inneholder normalt bare spor av CAI, men nivåene vil øke ved hemolyse [6]. Basert på dens lille størrelse (29 kDa og Stokes radius 25 Å [7-9] er CAI spådd å filtrere over den glomerulære barrieren og vises i urin [10]. Kvantitative immunteknikker kan oppdage CAI selv ved 1:10 000 fortynning. Urin fra friske voksne er normalt blottet for CAI, og produserer et svært lavt bakgrunnssignal. Urin-CAI-utskillelse forventes å være proporsjonal med omfanget av hemolyse, og fungerer derfor som en kvantitativ biomarkør som kan analyseres ikke-invasivt.

Mål for den (første) URICA-studien: Målet med den nå fullførte URICA-studien (Urinær utskillelse av karbonsyreanhydrase; prøveregistrering CPMS 19576) var å teste for tilstedeværelsen av CA-isoformer i urinen til fullbårne nyfødte innlagt til Evelinas barn Sykehus. Kohorten inkluderte kontroller som ikke ble mistenkt for å gjennomgå hemolyse (utover den milde fysiologiske formen) samt babyer med ABO-inkompatibilitet, anemi og under behandling for gulsott. URICA-studien oppnådde etisk godkjenning 12. mai 2015 (REC: 15/NS/0042). Innsamlingen og analysen av prøver ble fullført innen juni 2017. Målinger på urin består av western blotting for CAI (en sensitiv, men semikvantitativ metode), ELISA for CAI (en kvantitativ metode for å bestemme CAI-nivåer), massespesifikasjoner for å oppnå proteomet til urin, pluss målinger av totalt protein og kreatinin ( å vurdere bevis for nyresvikt som et eksklusjonskriterium). I tillegg ble det samlet inn kliniske data om svangerskap, og blodhemoglobin, serum eller transkutant bilirubin og C-reaktivt protein på flere tidspunkt, der det var mulig, for å teste for henholdsvis anemi, gulsott og infeksjon. 26 babyer ble rekruttert.

Utfall av URICA-studien: Western blotting viste ikke noe detekterbart CAI-signal i 9 prøver (kan ikke skilles fra bakgrunnssignal i voksen urin) og en rekke positive signaler i 17 prøver. Disse resultatene ble støttet av ELISA-målinger. To prøver hadde forhøyede protein/kreatinin-nivåer, noe som muligens tyder på nyreskade, men disse ga ikke CAI-positiv urin. Massespesifikasjonsanalyse viste at CAI-nivået ikke korrelerte med noe annet protein i røde blodlegemer, noe som tyder sterkt på at hemolysen hadde skjedd inne i kar og ikke i urinveiene (hvor det også ville føre til signaler fra f.eks. hemoglobin eller anionbytter 1). Sammenlignet med CAI-negativ urin, var det mest overrikelige proteinet i CAI-positive prøver faktisk CAI, noe som argumenterte for den utmerkede oppløsningsevnen til denne biomarkøren. Når man vurderer tidspunktet da urinen ble samlet inn, er det mulig å forklare CAI-signalet i forhold til bilirubinmålinger som følger:

• Seks babyer med underterskelbilirubinnivåer (NHS retningslinjer for fototerapi) produserte CAI-negativ urin;
• Hos seksten babyer med raskt og betydelig stigende bilirubinnivåer (14 av dem fikk fototerapi), var CAI-signalet sterkest i urinprøver som ble samlet nærmere bilirubintoppen, med en tendens til å antyde at CAI-toppen gikk foran bilirubintoppen;
• Fire babyer produserte urin med et veldig sterkt CAI-signal, men viste ikke forhøyet bilirubin, og argumenterte for at en distinkt mekanisme produserer hemolyse.

Hypoteser: Vi foreslår at urin-CAI er en biomarkør for hemolyse, og vi antar at:

1. Urin-CAI-signal kan stratifiseres for å relatere til den underliggende hemolytiske tilstanden:

   • ikke påviselig: indikerer ingen bevis for hemolyse;
   • mellomliggende: nivåer som indikerer hemolyse hos babyer med gulsott;
   • høyere terskel: indikerer en akutt hemolytisk krise som kanskje ikke fører til en økning i bilirubin.
2. I mellomområdet går et positivt urin-CAI-signal før toppen av bilirubin og er en tidlig indikator på gulsott.

5 Prøvemål og formål

Tidsforløpet til bilirubin brukes for tiden til å måle neonatal helse, men vi foreslår at urin-CAI-overvåking vil gi et tidlig varselsignal for å identifisere risikopasienter og dermed tillate neonatalavdelinger å bedre rasjonalisere ressursene sine. For å fastslå nytten av denne biomarkøren, foreslår vi å gjennomføre en longitudinell studie på en kohort av fullbårne babyer for å korrelere tidsforløpene av urin-CAI med bilirubin (for å teste hypotese 2), og for å få klinisk informasjon som kan bestemme årsaken. og omfanget av hemolyse (for å informere om terskelnivåer for hypotese 1).

Forskningsplan: Det er 9000 fødsler i året på St Thomas'. Av disse legges ~1000 babyer inn på Neonatal Intensive Care Unit (NICU) hvert år; omtrent halvparten av disse babyene blir født til termin. Noen ~300 vil ha gulsott som trenger fototerapi og ~10-20 vil ha alvorlig hemolyse (typisk ABO-inkompatibilitet). Målet er å rekruttere 30 fullbårne babyer, over en periode på ikke lenger enn 24 måneder, som forventes å forbli på nyfødtavdelingen i minst fem dager og opptil 10 dager hvor urinprøver vil bli tatt så regelmessig som mulig. (en gang om dagen; hvis ikke mulig, så minst en gang annenhver dag), tidsstemplet og lagret i en dedikert fryser for off-line analyse i Oxford, når rekrutteringen er fullført. Når det er mulig å utføre nær oppsamlingspunktet, vil et lite volum urin (ikke mer enn fire dråper) pipetteres på en lateral flow-enhet (LFD), levert som en del av et sett, for å oppnå en øyeblikkelig avlesning av CAI-immunreaktivitet . LFD merkes med matchende urinidentifikator og registreres (positiv/negativ/ugyldig). Hvis det ikke er mulig i nærheten av innsamlingspunktet, vil dette trinnet bli utført senere, i Oxford, på tinte prøver. Innen 6 timer etter urinprøven vil et ikke-invasivt transkutant bilirubinnivå bli oppnådd og registrert. Disse dataene vil bli supplert med følgende informasjon, innhentet som en del av normal klinisk praksis uten tilknytning til målene for studien.

• Serumbilirubin ble rutinemessig samlet
• Blodhemoglobin og full blodtelling
• C-reaktivt protein (CRP) og nyrefunksjon
• Gestasjonsalder;
• Varighet og tidspunkt for fototerapi
• Fødselsvekt
• Kjønn
• Resultat av direkte Coombs-test;
• Grunn til å bli innlagt på NICU.

Urinprøver vil bli analysert i Oxford i form av:

• CAI-immunreaktivitet på western blot, en svært sensitiv semi-kvantitativ metode;
• CAI-immunreaktivitet ved ELISA, en kvantitativ metode;
• Totalt protein og kreatinin som markører for nyreskade;
• Osmolaritet, for å bestemme vanndrivende tilstand. Alle prøver vil bli anonymisert med en alfanumerisk kode og knyttet til kliniske data. Babyer som får mindre enn 4 urinprøver fra vil bli ekskludert fra studien på grunnlag av at slike datasett ikke vil ha oppløsningsevnen til å teste hypotesene. Rekrutteringen vil fullføres når 30 babyer med minst 4 prøver er rekruttert. Babyer med kromosomavvik vil også bli ekskludert fra studien.