Eine Längsschnittstudie zur Analyse der Korrelation zwischen CAI und Bilirubin

Bei Neugeborenen kann die intravaskuläre Hämolyse von leicht im Rahmen des physiologischen Umsatzes roter Blutkörperchen bis zu schweren Fällen wie Gelbsucht oder ABO-Inkompatibilität reichen. Frühe Biomarker der Hämolyse würden die neonatologische Praxis verbessern, indem sie Risikopatienten identifizieren, insbesondere wenn der Assay einfach, schnell, nicht-invasiv und quantitativ ist. Unsere jetzt abgeschlossene URICA-Studie an voll ausgetragenen männlichen Babys (Studienregistrierung CPMS 19576) zeigte, dass das kleine zytoplasmatische Protein Carboanhydrase I (CAI), das reichlich in roten Blutkörperchen vorkommt, (durch Immunoassay und Massenspektrometrie) nachgewiesen wurde 17 von 26 Urinproben, die einmal pro rekrutiertem Baby auf der Neonatologiestation gesammelt wurden. CAI-positive Proben wurden von Babys mit Bilirubinspiegeln erhalten, die schnell ansteigen oder den Schwellenwert für eine Phototherapie überschreiten. CAI-negativer Urin wurde erhalten, wenn entweder das Bilirubin die Phototherapieschwelle nicht erreichte oder nachdem es sich von seinem Höchstwert erholt hatte. Bei vier Gelegenheiten war die Ursache für CAI-positiven Urin unbestimmt (https://doi.org/10.1093/jalm/jfaa051). Da CAI normalerweise nicht im Urin vorhanden ist, weist ein positives Signal auf eine intravaskuläre Hämolyse hin und bestätigt, dass CAI die glomeruläre Barriere passiert hat. Die quantitative Aussagekraft des Urin-CAI zur Vorhersage und Abschätzung einer bevorstehenden hämolytischen Krise erfordert jedoch eine neue Längsschnittstudie, die das Ziel der URICA-II-Studie ist.

Klinische Begründung: Die Gesundheit von Neugeborenen muss regelmäßig auf eine von vielen schnell fortschreitenden und potenziell lebensbedrohlichen Erkrankungen überwacht werden, die eine intravaskuläre Hämolyse implizieren. Dazu gehören Sepsis (z. Grampositive Bakterien), Protozoeninfektion (z. Malaria), Alloimmunität (ABO- und Rhesus-Inkompatibilität), genetische Merkmale (z. Sichelzellanämie, Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase [G6PD]-Mangel) oder Elektrolytstörungen. Einige dieser Bedingungen (z. RhD, G6PD, Sichel-Merkmal) sind besonders verbreitet in ethnischen Minderheitengruppen [1-4]. In fortgeschrittenen Gesundheitseinrichtungen umfassen Hämolysetests die Entnahme von Blutproben für mikroskopische Analysen (z. Zellzahl und Morphologie) oder biochemische Assays (z. B. für unkonjugiertes Bilirubin oder Laktatdehydrogenase). Andere ressourcenintensive Tests sind verfügbar, um spezifische Ursachen der Hämolyse zu diagnostizieren, wie z. B. autoimmune hämolytische Anämie mit dem Coombs-Test oder G6PD-Mangel durch Redox-Assays. Diese Tests erfordern geschultes Personal, fortschrittliche Laborgeräte und hohe Hygienestandards. Einfachere, kostengünstigere und schnellere Tests auf neuartige Biomarker von Krankheiten, angepasst an Point-of-Care- und minimale Laborbedingungen, wären medizinisch und wirtschaftlich gerechtfertigt. Diese Technologie würde auch den Entwicklungsländern zugute kommen, wo die Hämolyse häufiger vorkommen kann.

Wissenschaftlicher Hintergrund: Das lösliche Enzym Carboanhydrase I (CAI) ist nach Hämoglobin-Isoformen das am häufigsten vorkommende Protein im Zytoplasma roter Blutkörperchen [5]. Plasma enthält normalerweise nur Spuren von CAI, aber die Konzentrationen steigen bei Hämolyse [6]. Basierend auf seiner geringen Größe (29 kDa und Stokes-Radius 25 Å [7-9] wird CAI vorhergesagt, dass es die glomeruläre Barriere durchdringt und im Urin erscheint [10]. Quantitative Immuntechniken können CAI sogar bei einer Verdünnung von 1:10.000 nachweisen. Urin von gesunden Erwachsenen ist normalerweise frei von CAI, was ein sehr niedriges Hintergrundsignal erzeugt. Es wird erwartet, dass die CAI-Ausscheidung im Urin proportional zum Ausmaß der Hämolyse ist und daher als quantitativer Biomarker dient, der nicht-invasiv getestet werden kann.

Ziele der (ersten) URICA-Studie: Das Ziel der jetzt abgeschlossenen URICA-Studie (URInary excretion of Carboanhydrase; Studienregistrierung CPMS 19576) war der Test auf das Vorhandensein von CA-Isoformen im Urin von Neugeborenen, die bei Evelina's Children aufgenommen wurden Krankenhaus. Die Kohorte umfasste Kontrollpersonen, bei denen kein Verdacht auf Hämolyse (über die milde physiologische Form hinaus) bestand, sowie Babys mit ABO-Inkompatibilität, Anämie und in Behandlung wegen Gelbsucht. Die URICA-Studie erhielt am 12. Mai 2015 die ethische Genehmigung (REC: 15/NS/0042). Die Sammlung und Analyse der Proben wurde im Juni 2017 abgeschlossen. Urinmessungen, bestehend aus Western Blotting für CAI (eine empfindliche, aber halbquantitative Methode), ELISA für CAI (eine quantitative Methode zur Bestimmung von CAI-Spiegeln), Massenspektrometrie zur Gewinnung des Proteoms von Urin sowie Messungen von Gesamtprotein und Kreatinin ( Nachweis einer Niereninsuffizienz als Ausschlusskriterium zu werten). Darüber hinaus wurden zu mehreren Zeitpunkten, soweit möglich, klinische Daten über Schwangerschaft, Bluthämoglobin, Serum oder transkutanes Bilirubin und C-reaktives Protein erhoben, um auf Anämie, Gelbsucht bzw. Infektion zu testen. 26 Babys wurden rekrutiert.

Ergebnisse der URICA-Studie: Western Blotting zeigte kein nachweisbares CAI-Signal in 9 Proben (nicht unterscheidbar vom Hintergrundsignal im Urin von Erwachsenen) und eine Reihe positiver Signale in 17 Proben. Diese Ergebnisse wurden durch ELISA-Messungen gestützt. Zwei Proben wiesen erhöhte Protein-/Kreatininspiegel auf, was möglicherweise auf eine Nierenschädigung hinweist, jedoch ergaben diese keinen CAI-positiven Urin. Die Massenspektrometrie-Analyse zeigte, dass der CAI-Spiegel nicht mit irgendeinem anderen Protein der roten Blutkörperchen korrelierte, was stark darauf hinweist, dass die Hämolyse innerhalb der Gefäße und nicht in den Harnwegen aufgetreten war (wo sie auch zu Signalen von z. Hämoglobin oder Anionenaustauscher 1). Im Vergleich zu CAI-negativem Urin war das am häufigsten vorkommende Protein in CAI-positiven Proben tatsächlich CAI, was für das hervorragende Auflösungsvermögen dieses Biomarkers spricht. Betrachtet man den Zeitpunkt der Urinsammlung, lässt sich das CAI-Signal relativ zur Bilirubinmessung wie folgt erklären:

• Sechs Babys mit unterschwelligen Bilirubinspiegeln (NHS-Richtlinien für Phototherapie) produzierten CAI-negativen Urin;
• Bei sechzehn Babys mit schnell und signifikant ansteigendem Bilirubinspiegel (von denen 14 eine Phototherapie erhielten) war das CAI-Signal am stärksten in Urinproben, die näher am Bilirubin-Peak gesammelt wurden, mit einer Tendenz, darauf hinzuweisen, dass der CAI-Spitze dem Bilirubin-Peak vorausging;
• Vier Babys produzierten Urin mit einem sehr starken CAI-Signal, zeigten jedoch kein erhöhtes Bilirubin, was argumentiert, dass ein bestimmter Mechanismus Hämolyse hervorruft.

Hypothesen: Wir schlagen vor, dass Urin-CAI ein Biomarker der Hämolyse ist, und wir stellen folgende Hypothese auf:

1. Das CAI-Signal im Urin kann stratifiziert werden, um sich auf den zugrunde liegenden hämolytischen Zustand zu beziehen:

   • nicht nachweisbar: kein Hinweis auf Hämolyse;
   • mittel: Niveaus, die auf Hämolyse bei Babys mit Gelbsucht hindeuten;
   • höhere Schwelle: Zeigt eine akute hämolytische Krise an, die möglicherweise keinen Anstieg des Bilirubins hervorruft.
2. Im mittleren Bereich geht ein positives CAI-Signal im Urin dem Bilirubin-Peak voraus und ist ein früher Indikator für Gelbsucht.

5 Ziele und Zweck der Studie

Der Zeitverlauf von Bilirubin wird derzeit verwendet, um die Gesundheit von Neugeborenen zu beurteilen, aber wir schlagen vor, dass die Urin-CAI-Überwachung ein Frühwarnzeichen für die Identifizierung von Risikopatienten liefern und es den Neugeborenenstationen somit ermöglichen würde, ihre Ressourcen besser zu rationalisieren. Um die Nützlichkeit dieses Biomarkers zu belegen, schlagen wir vor, eine Längsschnittstudie an einer Kohorte von termingerecht geborenen Babys durchzuführen, um die zeitlichen Verläufe von CAI im Urin mit Bilirubin zu korrelieren (um Hypothese 2 zu testen) und um klinische Informationen zu erhalten, die die Ursache bestimmen können und Ausmaß der Hämolyse (um Schwellenwerte für Hypothese 1 zu informieren).

Forschungsplan: In St. Thomas gibt es 9.000 Geburten pro Jahr. Davon werden jedes Jahr etwa 1000 Babys auf der neonatalen Intensivstation (NICU) aufgenommen; Etwa die Hälfte dieser Babys wird termingerecht geboren. Etwa 300 haben eine Gelbsucht, die eine Phototherapie benötigt, und etwa 10-20 haben eine schwere Hämolyse (typischerweise eine ABO-Inkompatibilität). Ziel ist die Rekrutierung von 30 Vollzeitbabys über einen Zeitraum von nicht mehr als 24 Monaten, die voraussichtlich mindestens fünf Tage und bis zu 10 Tage auf der Neugeborenenstation bleiben, während denen so regelmäßig wie möglich Urinproben entnommen werden (einmal täglich; wenn nicht möglich, dann mindestens einmal alle zwei Tage), mit Zeitstempel versehen und in einem speziellen Gefrierschrank zur Offline-Analyse in Oxford aufbewahrt, sobald die Rekrutierung abgeschlossen ist. Wenn dies in der Nähe des Sammelpunkts möglich ist, wird eine kleine Menge Urin (nicht mehr als vier Tropfen) auf ein Lateral-Flow-Gerät (LFD) pipettiert, das als Teil eines Kits bereitgestellt wird, um eine sofortige Anzeige der CAI-Immunreaktivität zu erhalten . Der LFD wird mit der passenden Urinkennung beschriftet und aufgezeichnet (positiv/negativ/ungültig). Wenn dies in der Nähe des Entnahmepunkts nicht möglich ist, wird dieser Schritt später in Oxford an aufgetauten Proben durchgeführt. Innerhalb von 6 Stunden nach der Urinprobe wird ein nicht-invasiver transkutaner Bilirubinspiegel erhalten und aufgezeichnet. Diese Daten werden durch die folgenden Informationen ergänzt, die im Rahmen der normalen klinischen Praxis ohne Bezug zu den Zielen der Studie gewonnen wurden.

• Serumbilirubin wurde routinemäßig gesammelt
• Bluthämoglobin und Vollblutbild
• C-reaktives Protein (CRP) und Nierenfunktion
• Gestationsalter;
• Dauer und Zeitpunkt der Phototherapie
• Geburtsgewicht
• Sex
• Ergebnis des direkten Coombs-Tests;
• Grund für die Aufnahme in die NICU.

Urinproben werden in Oxford analysiert auf:

• CAI-Immunreaktivität im Western Blot, einer hochempfindlichen halbquantitativen Methode;
• CAI-Immunreaktivität durch ELISA, ein quantitatives Verfahren;
• Gesamtprotein und Kreatinin als Marker für Nierenschäden;
• Osmolarität, um den diuretischen Zustand zu bestimmen. Alle Proben werden mit einem alphanumerischen Code anonymisiert und mit klinischen Daten verknüpft. Babys, von denen weniger als 4 Urinproben entnommen werden, werden von der Studie ausgeschlossen, da solche Datensätze nicht das Auflösungsvermögen hätten, um die Hypothesen zu testen. Die Rekrutierung ist abgeschlossen, wenn 30 Babys mit mindestens 4 Proben rekrutiert wurden. Babys mit Chromosomenanomalien werden ebenfalls von der Studie ausgeschlossen.