Um estudo longitudinal para analisar a correlação entre CAI e bilirrubina

Em recém-nascidos, a hemólise intravascular pode variar de leve, como parte da renovação fisiológica das hemácias, a grave em casos como icterícia ou incompatibilidade ABO. Biomarcadores precoces de hemólise melhorariam a prática da neonatologia ao identificar pacientes de risco, principalmente se o ensaio for simples, rápido, não invasivo e quantitativo. Nosso estudo URICA agora concluído em bebês do sexo masculino a termo (registro de estudo CPMS 19576) mostrou que a pequena proteína citoplasmática anidrase carbônica I (CAI), encontrada abundantemente em glóbulos vermelhos, foi detectada (por imunoensaio e espectroscopia de massa), em 17 de 26 amostras de urina coletadas uma vez por bebê recrutado na enfermaria de neonatologia. As amostras positivas para CAI foram obtidas de bebês com níveis de bilirrubina que estão subindo rapidamente ou atingindo um pico acima do limite para fototerapia. Urina CAI-negativa foi obtida quando a bilirrubina não atingiu o limiar de fototerapia ou após ter se recuperado de seu pico. Em quatro ocasiões, a causa da urina positiva para CAI foi indeterminada (https://doi.org/10.1093/jalm/jfaa051). Como o CAI está normalmente ausente da urina, um sinal positivo é indicativo de hemólise intravascular e confirma que o CAI atravessou a barreira glomerular. No entanto, o poder quantitativo do IAC urinário para prever e estimar uma crise hemolítica iminente requer um novo estudo longitudinal, que é o objetivo do estudo URICA-II.

Justificativa clínica: A saúde dos recém-nascidos deve ser monitorada regularmente para uma das muitas condições rapidamente progressivas e potencialmente fatais que implicam em hemólise intravascular. Estes incluem sepse (por exemplo, bactérias Gram-positivas), infecção por protozoários (p. malária), aloimunidade (incompatibilidade ABO e Rhesus), características genéticas (p. anemia falciforme, deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase [G6PD]) ou desequilíbrio eletrolítico. Algumas dessas condições (p. RhD, G6PD, traço falciforme) são particularmente prevalentes em grupos étnicos minoritários [1-4]. Em unidades de saúde avançadas, os testes de hemólise envolvem a coleta de amostras de sangue para análises de microscopia (por exemplo, contagem de células e morfologia) ou ensaios bioquímicos (por exemplo, para bilirrubina não conjugada ou lactato desidrogenase). Outros testes de recursos intensivos estão disponíveis para diagnosticar causas específicas de hemólise, como anemia hemolítica autoimune com teste de Coombs ou deficiência de G6PD por ensaios redox. Esses testes requerem pessoal treinado, equipamentos avançados de laboratório e altos padrões de higiene. Testes mais simples, baratos e rápidos em novos biomarcadores de doenças, adaptados para condições laboratoriais mínimas no local de atendimento, seriam médica e economicamente justificados. Essa tecnologia também beneficiaria o mundo em desenvolvimento, onde a hemólise pode ser mais comum.

Embasamento científico: A enzima solúvel anidrase carbônica I (CAI) é, depois das isoformas da hemoglobina, a proteína mais abundante no citoplasma das hemácias [5]. O plasma normalmente contém apenas vestígios de CAI, mas os níveis aumentarão após a hemólise [6]. Com base em seu pequeno tamanho (29 kDa e raio de Stokes 25 Å [7-9] CAI é previsto para filtrar através da barreira glomerular e aparecer na urina [10]. Imunotécnicas quantitativas podem detectar CAI mesmo na diluição de 1:10.000. A urina de adultos saudáveis ​​é normalmente desprovida de CAI, produzindo um sinal de fundo muito baixo. Espera-se que a excreção urinária de CAI seja proporcional à extensão da hemólise e, portanto, sirva como um biomarcador quantitativo que pode ser analisado de forma não invasiva.

Objetivos do (primeiro) estudo URICA: O objetivo do estudo URICA agora concluído (excreção urinária de anidrase carbônica; registro do estudo CPMS 19576) foi testar a presença de isoformas CA na urina de recém-nascidos a termo internados no Evelina's Children Hospital. A coorte incluiu controles sem suspeita de hemólise (além da forma fisiológica leve), bem como bebês com incompatibilidade ABO, anemia e em tratamento para icterícia. O estudo URICA obteve aprovação ética em 12 de maio de 2015 (REC: 15/NS/0042). A coleta e análise das amostras foi concluída em junho de 2017. Medições na urina compostas por western blotting para CAI (um método sensível, mas semiquantitativo), ELISA para CAI (um método quantitativo para determinar os níveis de CAI), espectroscopia de massa para obter o proteoma da urina, além de medições de proteína total e creatinina ( para avaliar a evidência de insuficiência renal como critério de exclusão). Além disso, foram coletados dados clínicos sobre gestação e hemoglobina sanguínea, bilirrubina sérica ou transcutânea e proteína C-reativa em vários momentos, sempre que possível, para testar anemia, icterícia e infecção, respectivamente. 26 bebês foram recrutados.

Resultados do estudo URICA: Western blotting não mostrou sinal CAI detectável em 9 amostras (indistinguível do sinal de fundo na urina de adulto) e uma gama de sinais positivos em 17 amostras. Estes resultados foram apoiados por medições ELISA. Duas amostras tinham níveis elevados de proteína/creatinina, possivelmente indicando dano renal, mas não produziram urina positiva para CAI. A análise de espectroscopia de massa mostrou que o nível de CAI não se correlacionou com nenhuma outra proteína de glóbulos vermelhos, indicando fortemente que a hemólise ocorreu dentro dos vasos e não no trato urinário (onde também levaria a sinais de, por exemplo, hemoglobina ou trocador de ânions 1). Quando comparada com a urina CAI-negativa, a proteína mais abundante nas amostras CAI-positivas era, de fato, o CAI, argumentando a favor do excelente poder de resolução desse biomarcador. Ao considerar o momento em que a urina foi coletada, é possível explicar o sinal CAI em relação às medições de bilirrubina da seguinte forma:

• Seis bebês com níveis de bilirrubina abaixo do limiar (diretrizes do NHS para fototerapia) produziram urina CAI negativa;
• Em dezesseis bebês com aumento rápido e significativo dos níveis de bilirrubina (14 dos quais receberam fototerapia), o sinal CAI foi mais forte em amostras de urina coletadas próximo ao pico de bilirrubina, com tendência a sugerir que o pico CAI precedeu o pico de bilirrubina;
• Quatro bebês produziram urina com um sinal CAI muito forte, mas não manifestaram bilirrubina elevada, argumentando que um mecanismo distinto está produzindo hemólise.

Hipóteses: Propomos que o CAI urinário seja um biomarcador de hemólise e levantamos a hipótese de que:

1. O sinal de CAI urinário pode ser estratificado para se relacionar com o estado hemolítico subjacente:

   • indetectável: indicando nenhuma evidência de hemólise;
   • intermediário: níveis que indicam hemólise em bebês ictéricos;
   • limiar mais alto: indicando uma crise hemolítica aguda que pode não provocar um aumento da bilirrubina.
2. Na faixa intermediária, um sinal CAI urinário positivo precede o pico de bilirrubina e é um indicador precoce de icterícia.

5 Objetivos e finalidade do estudo

O curso temporal da bilirrubina é atualmente usado para avaliar a saúde neonatal, mas propomos que o monitoramento urinário do IAC forneceria um sinal de alerta precoce para identificar pacientes em risco e, assim, permitir que as enfermarias neonatais racionalizassem melhor seus recursos. Para estabelecer a utilidade deste biomarcador, propomos realizar um estudo longitudinal em uma coorte de bebês nascidos a termo para correlacionar os tempos de IAC urinário com bilirrubina (para testar a hipótese 2) e obter informações clínicas que possam determinar a causa e extensão da hemólise (para informar os níveis de limiar para a hipótese 1).

Plano de pesquisa: Há 9.000 nascimentos por ano em St Thomas'. Destes, aproximadamente 1.000 bebês são internados na Unidade de Terapia Intensiva Neonatal (UTIN) a cada ano; aproximadamente metade desses bebês nascem a termo. Cerca de ~300 terão icterícia necessitando de fototerapia e ~10-20 terão hemólise grave (tipicamente incompatibilidade ABO). O objetivo é recrutar 30 bebês nascidos a termo, em um período não superior a 24 meses, que permaneçam na unidade neonatal por pelo menos cinco dias e até 10 dias, durante os quais serão coletadas amostras de urina com a maior regularidade possível (uma vez por dia; se não for possível, pelo menos uma vez a cada dois dias), carimbado com a hora e armazenado em um freezer dedicado para análise off-line em Oxford, após a conclusão do recrutamento. Quando viável para realizar próximo ao ponto de coleta, um pequeno volume de urina (não mais que quatro gotas) será pipetado em um dispositivo de fluxo lateral (LFD), fornecido como parte de um kit, para obter uma leitura instantânea da imunorreatividade CAI . O LFD deve ser rotulado com o identificador de urina correspondente e registrado (positivo/negativo/vazio). Se não for viável próximo ao ponto de coleta, esta etapa será realizada posteriormente, em Oxford, em amostras descongeladas. Dentro de 6 horas da amostra de urina, um nível de bilirrubina transcutâneo não invasivo será obtido e registrado. Esses dados serão complementados com as seguintes informações, obtidas como parte da prática clínica normal não relacionada aos objetivos do estudo.

• A bilirrubina sérica onde rotineiramente coletada
• Hemoglobina sanguínea e hemograma completo
• Proteína C reativa (PCR) e função renal
• Idade gestacional;
• Duração e momento da fototerapia
• Peso ao nascer
• Sexo
• Resultado do teste direto de Coombs;
• Motivo da internação na UTIN.

As amostras de urina serão analisadas em Oxford em termos de:

• imunorreatividade CAI em western blot, um método semi-quantitativo altamente sensível;
• imunorreatividade CAI por ELISA, um método quantitativo;
• Proteína total e creatinina como marcadores de dano renal;
• Osmolaridade, para determinar o estado diurético. Todas as amostras serão anonimizadas com um código alfanumérico e vinculadas a dados clínicos. Os bebês dos quais foram obtidas menos de 4 amostras de urina serão excluídos do estudo com base no fato de que tais conjuntos de dados não teriam o poder de resolução para testar as hipóteses. O recrutamento será concluído quando 30 bebês com pelo menos 4 amostras forem recrutados. Bebês com anormalidades cromossômicas também serão excluídos do estudo.