Продольное исследование для анализа корреляции между CAI и билирубином

У новорожденных внутрисосудистый гемолиз может варьироваться от легкого, как часть физиологического оборота эритроцитов, до тяжелого в таких случаях, как желтуха или несовместимость по системе АВО. Ранние биомаркеры гемолиза улучшат неонатологическую практику, выявляя пациентов из группы риска, особенно если анализ будет простым, быстрым, неинвазивным и количественным. Наше уже завершенное исследование URICA на доношенных младенцах мужского пола (регистрация исследования CPMS 19576) показало, что небольшой цитоплазматический белок карбоангидраза I (CAI), в изобилии обнаруженный в эритроцитах, был обнаружен (с помощью иммуноанализа и масс-спектрометрии) в 17 из 26 образцов мочи, собранных один раз на ребенка, завербованного в неонатологическом отделении. CAI-положительные образцы были получены от детей с уровнем билирубина, который быстро растет или превышает пороговое значение для фототерапии. CAI-отрицательная моча была получена, когда билирубин либо не достиг порога фототерапии, либо после того, как он восстановился после своего пика. В четырех случаях причина CAI-положительной мочи не была установлена ​​(https://doi.org/10.1093/jalm/jfaa051). Поскольку CAI обычно отсутствует в моче, положительный сигнал свидетельствует о внутрисосудистом гемолизе и подтверждает, что CAI преодолел гломерулярный барьер. Однако количественная сила CAI в моче для прогнозирования и оценки надвигающегося гемолитического криза требует нового лонгитюдного исследования, которое является целью исследования URICA-II.

Клиническое обоснование: состояние здоровья новорожденных необходимо регулярно контролировать на предмет одного из многих быстро прогрессирующих и потенциально опасных для жизни состояний, которые связаны с внутрисосудистым гемолизом. К ним относятся сепсис (например, грамположительные бактерии), протозойная инфекция (например, малярия), аллоиммунитет (несовместимость по системе АВО и резус), генетические особенности (например, серповидноклеточная анемия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [G6PD]) или дисбаланс электролитов. Некоторые из этих состояний (например, RhD, G6PD, серповидный признак) особенно распространены в этнических меньшинствах [1-4]. В передовых медицинских учреждениях тесты на гемолиз включают взятие образцов крови для микроскопического анализа (например, количество клеток и морфология) или биохимические анализы (например, на неконъюгированный билирубин или лактатдегидрогеназу). Другие ресурсоемкие тесты доступны для диагностики конкретных причин гемолиза, таких как аутоиммунная гемолитическая анемия с тестом Кумбса или дефицит G6PD с помощью окислительно-восстановительных анализов. Эти тесты требуют обученного персонала, передового лабораторного оборудования и высоких стандартов гигиены. Более простые, дешевые и быстрые тесты на новые биомаркеры заболеваний, адаптированные для оказания медицинской помощи в минимальных лабораторных условиях, были бы оправданы с медицинской и экономической точек зрения. Эта технология также принесет пользу развивающимся странам, где гемолиз может быть более распространенным явлением.

Научная основа: Растворимый фермент карбоангидраза I (CAI) является после изоформ гемоглобина наиболее распространенным белком в цитоплазме эритроцитов [5]. В норме плазма содержит только следовые количества CAI, но при гемолизе его уровень повышается [6]. Исходя из своего небольшого размера (29 кДа и радиуса Стокса 25 Å [7-9]), предполагается, что CAI фильтруется через гломерулярный барьер и появляется в моче [10]. Количественные иммунометоды позволяют выявить CAI даже при разведении 1:10 000. Моча здоровых взрослых обычно не содержит CAI, что дает очень низкий фоновый сигнал. Ожидается, что экскреция CAI с мочой пропорциональна степени гемолиза и, следовательно, служит количественным биомаркером, который можно оценить неинвазивно.

Цели (первого) исследования URICA: Цель уже завершенного исследования URICA (выделение карбоангидразы с мочой; регистрация исследования CPMS 19576) заключалась в проверке наличия изоформ СА в моче доношенных новорожденных, поступивших в клинику Evelina's Children. Больница. В когорту вошли контрольные дети, у которых не было подозрений на гемолиз (кроме легкой физиологической формы), а также дети с АВО-несовместимостью, анемией и проходившие лечение по поводу желтухи. Исследование URICA получило этическое одобрение 12 мая 2015 г. (REC: 15/NS/0042). Сбор и анализ проб завершен к июню 2017 года. Измерения мочи, включающие вестерн-блоттинг для CAI (чувствительный, но полуколичественный метод), ELISA для CAI (количественный метод определения уровней CAI), масс-спектрометрию для получения протеома мочи, а также измерения общего белка и креатинина ( для оценки признаков почечной недостаточности в качестве критерия исключения). Кроме того, были собраны клинические данные о беременности и гемоглобине крови, сывороточном или чрескожном билирубине и С-реактивном белке в несколько моментов времени, где это возможно, для проверки на анемию, желтуху и инфекцию соответственно. Было набрано 26 малышей.

Результаты исследования URICA: Вестерн-блоттинг показал отсутствие обнаруживаемого сигнала CAI в 9 образцах (неотличимый от фонового сигнала в моче взрослых) и ряд положительных сигналов в 17 образцах. Эти результаты были подтверждены измерениями ELISA. В двух образцах были повышены уровни белка/креатинина, что, возможно, указывает на повреждение почек, однако они не давали CAI-положительной мочи. Масс-спектральный анализ показал, что уровень CAI не коррелировал с каким-либо другим белком эритроцитов, что убедительно указывает на то, что гемолиз произошел внутри сосудов, а не в мочевыводящих путях (где это также привело бы к сигналам, например, от гемоглобин или анионит 1). По сравнению с CAI-отрицательной мочой, наиболее избыточным белком в CAI-положительных образцах фактически был CAI, что свидетельствует о превосходной разрешающей способности этого биомаркера. При рассмотрении момента времени, когда была собрана моча, можно объяснить сигнал CAI по отношению к измерениям билирубина следующим образом:

• Шесть детей с подпороговым уровнем билирубина (рекомендации NHS по фототерапии) дали CAI-отрицательную мочу;
• У шестнадцати детей с быстро и значительно повышающимся уровнем билирубина (14 из которых получали фототерапию) сигнал CAI был самым сильным в образцах мочи, которые были собраны ближе к пику билирубина, с тенденцией предположить, что пик CAI предшествовал пику билирубина;
• Четыре младенца произвели мочу с очень сильным сигналом CAI, но не показали повышенного билирубина, утверждая, что другой механизм вызывает гемолиз.

Гипотезы: мы предполагаем, что CAI в моче является биомаркером гемолиза, и мы предполагаем, что:

1. Сигнал CAI в моче может быть стратифицирован в соответствии с лежащим в основе гемолитическим состоянием:

   • неопределяемый: указывает на отсутствие признаков гемолиза;
   • промежуточный: уровни, указывающие на гемолиз у детей с желтухой;
   • более высокий порог: указывает на острый гемолитический криз, который может не вызывать повышения уровня билирубина.
2. В промежуточном диапазоне положительный сигнал CAI в моче предшествует пику билирубина и является ранним индикатором желтухи.

5 Цели и цель испытания

Динамика уровня билирубина в настоящее время используется для оценки состояния здоровья новорожденных, но мы предполагаем, что мониторинг CAI в моче будет служить сигналом раннего предупреждения для выявления пациентов из группы риска и, таким образом, позволит неонатальным отделениям лучше рационализировать свои ресурсы. Чтобы установить полезность этого биомаркера, мы предлагаем провести лонгитюдное исследование когорты доношенных детей, чтобы сопоставить временную динамику CAI в моче с билирубином (для проверки гипотезы 2) и получить клиническую информацию, которая может определить причину. и степень гемолиза (для информирования пороговых уровней для гипотезы 1).

План исследования: в Сент-Томасе рождается 9000 детей в год. Из них около 1000 младенцев ежегодно госпитализируются в отделение интенсивной терапии новорожденных (ОИТН); примерно половина этих детей рождается в срок. Около 300 человек будут иметь желтуху, требующую фототерапии, а ~ 10-20 человек будут иметь тяжелый гемолиз (как правило, АВО-несовместимость). Цель состоит в том, чтобы набрать 30 доношенных детей в течение периода не более 24 месяцев, которые, как ожидается, останутся в неонатальном отделении в течение как минимум пяти дней и до 10 дней, в течение которых образцы мочи будут браться как можно чаще. (один раз в день; если это невозможно, то не реже одного раза в два дня), с отметкой времени и хранением в специальном морозильнике для автономного анализа в Оксфорде после завершения набора. Если это возможно сделать близко к месту сбора, небольшой объем мочи (не более четырех капель) будет пипетирован в устройство латерального потока (LFD), входящее в комплект, для получения мгновенных показаний иммунореактивности CAI. . LFD должен быть помечен соответствующим идентификатором мочи и записан (положительный/отрицательный/аннулированный). Если это невозможно вблизи места сбора, этот шаг будет выполнен позже, в Оксфорде, на размороженных образцах. В течение 6 часов после взятия мочи будет получен и зарегистрирован неинвазивный чрескожный уровень билирубина. Эти данные будут дополнены следующей информацией, полученной в рамках обычной клинической практики, не связанной с целями исследования.

• Билирубин сыворотки, где рутинно собирают
• Гемоглобин крови и общий анализ крови
• С-реактивный белок (СРБ) и функция почек
• Гестационный возраст;
• Продолжительность и сроки фототерапии
• Вес при рождении
• Секс
• Результат прямого теста Кумбса;
• Причина госпитализации в ОРИТ.

Образцы мочи будут проанализированы в Оксфорде с точки зрения:

• Иммунореактивность CAI на вестерн-блоттинге, высокочувствительный полуколичественный метод;
• иммунореактивность CAI методом ИФА, количественный метод;
• Общий белок и креатинин как маркеры поражения почек;
• Осмолярность для определения диуретического состояния. Все образцы будут анонимизированы с помощью буквенно-цифрового кода и связаны с клиническими данными. Младенцы, у которых было получено менее 4 образцов мочи, будут исключены из исследования на том основании, что такие наборы данных не будут иметь разрешающей способности для проверки гипотез. Набор завершится, когда будет набрано 30 младенцев с не менее чем 4 образцами. Дети с хромосомными аномалиями также будут исключены из исследования.