Longitudinální studie k analýze korelace mezi CAI a bilirubinem

U novorozenců se intravaskulární hemolýza může pohybovat od mírné, jako součást fyziologického obratu červených krvinek, až po těžkou v případech, jako je žloutenka nebo inkompatibilita ABO. Časné biomarkery hemolýzy by zlepšily neonatologickou praxi identifikací rizikových pacientů, zejména pokud je test jednoduchý, rychlý, neinvazivní a kvantitativní. Naše nyní dokončená studie URICA na donošených mužských dětech (registrace pokusu CPMS 19576) ukázala, že malý cytoplazmatický protein karboanhydráza I (CAI), který se hojně nachází v červených krvinkách, byl detekován (imunoanalýzou a hmotnostní specifikací) v 17 z 26 vzorků moči odebraných jednou za přijaté dítě na neonatologickém oddělení. CAI-pozitivní vzorky byly získány od dětí s hladinami bilirubinu, které rychle stoupají nebo dosahují vrcholu nad prahem pro fototerapii. CAI-negativní moč byla získána, když buď bilirubin nedosáhl prahu fototerapie, nebo poté, co se zotavil ze svého maxima. Ve čtyřech případech nebyla příčina CAI-pozitivní moči určena (https://doi.org/10.1093/jalm/jfaa051). Protože CAI normálně v moči chybí, pozitivní signál svědčí o intravaskulární hemolýze a potvrzuje, že CAI prošel glomerulární bariérou. Kvantitativní schopnost močového CAI předpovídat a odhadovat blížící se hemolytickou krizi však vyžaduje novou longitudinální studii, která je cílem studie URICA-II.

Klinické zdůvodnění: Zdraví novorozenců musí být pravidelně sledováno kvůli jednomu z mnoha rychle progredujících a potenciálně život ohrožujících stavů, které implikují intravaskulární hemolýzu. Patří mezi ně sepse (např. Gram-pozitivní bakterie), protozoální infekce (např. malárie), aloimunita (nekompatibilita ABO a Rhesus), genetické vlastnosti (např. srpkovitá anémie, nedostatek glukózo-6-fosfátdehydrogenázy [G6PD]) nebo nerovnováha elektrolytů. Některé z těchto podmínek (např. RhD, G6PD, srpovitý rys) převládají zejména u menšinových etnických skupin [1–4]. V moderních zdravotnických zařízeních zahrnují testy na hemolýzu odběr vzorků krve pro mikroskopické analýzy (např. počet buněk a morfologie) nebo biochemické testy (např. pro nekonjugovaný bilirubin nebo laktátdehydrogenázu). K diagnostice specifických příčin hemolýzy jsou k dispozici další testy náročné na zdroje, jako je autoimunitní hemolytická anémie s Coombsovým testem nebo deficit G6PD pomocí redoxních testů. Tyto testy vyžadují vyškolený personál, moderní laboratorní vybavení a vysoké hygienické standardy. Jednodušší, levnější a rychlejší testy na nových biomarkerech onemocnění, přizpůsobené pro podmínky v místě péče a minimální laboratorní podmínky, by byly lékařsky a ekonomicky odůvodněné. Tato technologie by také prospěla rozvojovému světu, kde může být hemolýza běžnější.

Vědecké pozadí: Rozpustný enzym karboanhydráza I (CAI) je po izoformách hemoglobinu nejhojnějším proteinem v cytoplazmě červených krvinek [5]. Plazma normálně obsahuje pouze stopová množství CAI, ale hladiny se po hemolýze zvýší [6]. Na základě své malé velikosti (29 kDa a Stokesův poloměr 25 Å [7-9] se předpokládá, že CAI bude filtrovat přes glomerulární bariéru a objeví se v moči [10]. Kvantitativní imunotechniky mohou detekovat CAI i při ředění 1:10 000. Moč zdravých dospělých normálně neobsahuje CAI a vytváří velmi nízký signál pozadí. Očekává se, že vylučování CAI močí bude úměrné rozsahu hemolýzy, a proto slouží jako kvantitativní biomarker, který lze neinvazivně testovat.

Cíle (první) studie URICA: Cílem nyní dokončené studie URICA (Vylučování karboanhydrázy v moči; registrace studie CPMS 19576) bylo otestovat přítomnost izoforem CA v moči donošených novorozenců přijatých do Evelina's Children NEMOCNICE. Soubor zahrnoval kontroly, u kterých nebylo podezření na hemolýzu (mimo lehkou fyziologickou formu), stejně jako děti s inkompatibilitou ABO, anémií a podstupujícími léčbu žloutenky. Studie URICA získala etické schválení dne 12. května 2015 (REC: 15/NS/0042). Odběr a analýza vzorků byla dokončena do června 2017. Měření v moči se skládá z western blottingu na CAI (citlivá, ale semikvantitativní metoda), ELISA na CAI (kvantitativní metoda pro stanovení hladin CAI), hmotnostní specifikace pro získání proteomu moči, plus měření celkového proteinu a kreatininu ( k posouzení důkazů selhání ledvin jako vylučovacího kritéria). Kromě toho byly shromážděny klinické údaje o gestaci a krevním hemoglobinu, sérovém nebo transkutánním bilirubinu a C-reaktivním proteinu v několika časových bodech, kde to bylo možné, pro testování anémie, žloutenky a infekce. Bylo přijato 26 miminek.

Výsledky studie URICA: Western blotting neukázal žádný detekovatelný signál CAI v 9 vzorcích (nerozeznatelný od signálu pozadí v moči dospělých) a řadu pozitivních signálů v 17 vzorcích. Tyto výsledky byly podpořeny měřením ELISA. Dva vzorky měly zvýšené hladiny proteinu/kreatininu, což možná ukazovalo na poškození ledvin, ale neprodukovaly moč pozitivní na CAI. Hmotnostní spec analýza ukázala, že hladina CAI nekoreluje s žádným jiným proteinem červených krvinek, což silně naznačuje, že k hemolýze došlo uvnitř cév a ne v močovém traktu (kde by také vedla k signálům např. hemoglobin nebo aniontoměnič 1). Ve srovnání s močí negativní na CAI byl nejhojnějším proteinem ve vzorcích pozitivních na CAI ve skutečnosti CAI, což argumentuje vynikající rozlišovací schopností tohoto biomarkeru. Když vezmeme v úvahu časový bod, ve kterém byla odebrána moč, je možné vysvětlit signál CAI ve vztahu k měření bilirubinu následovně:

• Šest dětí s podprahovými hladinami bilirubinu (směrnice NHS pro fototerapii) produkovalo CAI-negativní moč;
• U šestnácti dětí s rychle a významně stoupajícími hladinami bilirubinu (14 z nich podstoupilo fototerapii) byl signál CAI nejsilnější ve vzorcích moči odebraných blíže k vrcholu bilirubinu, s tendencí naznačovat, že vrchol CAI předcházel vrcholu bilirubinu;
• Čtyři děti produkovaly moč s velmi silným signálem CAI, ale nevykazovaly zvýšený bilirubin, což tvrdí, že hemolýzu vyvolává odlišný mechanismus.

Hypotézy: Navrhujeme, že močový CAI je biomarkerem hemolýzy, a předpokládáme, že:

1. Signál CAI v moči lze stratifikovat tak, aby se vztahoval k základnímu hemolytickému stavu:

   • nedetekovatelné: neindikuje žádné známky hemolýzy;
   • střední: hladiny, které indikují hemolýzu u dětí se žloutenkou;
   • vyšší práh: indikuje akutní hemolytickou krizi, která nemusí vyvolat vzestup bilirubinu.
2. Ve středním rozmezí pozitivní močový CAI signál předchází vrcholu bilirubinu a je časným indikátorem žloutenky.

5 Cíle a účel pokusu

Časový průběh bilirubinu se v současnosti používá k měření zdraví novorozenců, ale navrhujeme, aby monitorování CAI v moči poskytlo včasné varovné znamení pro identifikaci rizikových pacientů, a umožnilo tak novorozeneckým oddělením lépe racionalizovat své zdroje. Abychom stanovili užitečnost tohoto biomarkeru, navrhujeme provést longitudinální studii na kohortě donošených dětí, abychom korelovali časové průběhy močového CAI s bilirubinem (k testování hypotézy 2) a abychom získali klinické informace, které mohou určit příčinu a rozsah hemolýzy (pro informaci o prahových úrovních pro hypotézu 1).

Výzkumný plán: Na Svatém Tomáši se ročně narodí 9 000 dětí. Z toho přibližně 1000 dětí je ročně přijato na jednotku intenzivní péče pro novorozence (NICU); přibližně polovina těchto dětí se rodí v termínu. Asi ~300 bude mít žloutenku vyžadující fototerapii a ~10-20 bude mít těžkou hemolýzu (typicky inkompatibilitu ABO). Cílem je získat 30 donošených dětí po dobu ne delší než 24 měsíců, u kterých se očekává, že zůstanou na novorozeneckém oddělení po dobu nejméně pěti dnů a nejvýše 10 dnů, během nichž budou co nejpravidelněji odebírány vzorky moči. (jednou denně; pokud to není možné, pak alespoň jednou za dva dny), označeno časovým razítkem a po dokončení náboru uloženo ve vyhrazeném mrazáku pro off-line analýzu v Oxfordu. Pokud je to možné provést v blízkosti místa odběru, bude malý objem moči (ne více než čtyři kapky) napipetován do zařízení pro laterální průtok (LFD), které je součástí sady, aby se získal okamžitý odečet imunoreaktivity CAI. . LFD se označí odpovídajícím identifikátorem moči a zaznamená se (pozitivní/negativní/neplatná). Pokud to není možné v blízkosti místa odběru, bude tento krok proveden později, v Oxfordu, na rozmražených vzorcích. Do 6 hodin od vzorku moči bude získána a zaznamenána neinvazivní transkutánní hladina bilirubinu. Tyto údaje budou doplněny následujícími informacemi získanými jako součást běžné klinické praxe nesouvisející s cíli studie.

• Sérový bilirubin byl rutinně odebírán
• Krevní hemoglobin a úplný krevní obraz
• C-reaktivní protein (CRP) a funkce ledvin
• Gestační věk;
• Délka a načasování fototerapie
• Váha při narození
• Sex
• Výsledek přímého Coombsova testu;
• Důvod přijetí na NICU.

Vzorky moči budou analyzovány v Oxfordu z hlediska:

• CAI imunoreaktivita na western blotu, vysoce citlivá semikvantitativní metoda;
• CAI imunoreaktivita pomocí ELISA, kvantitativní metoda;
• Celkový protein a kreatinin jako markery poškození ledvin;
• Osmolarita ke stanovení diuretického stavu. Všechny vzorky budou anonymizovány pomocí alfanumerického kódu a propojeny s klinickými údaji. Děti, od kterých byly získány méně než 4 vzorky moči, budou ze studie vyloučeny na základě toho, že takové soubory dat by neměly rozlišovací schopnost pro testování hypotéz. Nábor bude dokončen, když bude přijato 30 miminek s alespoň 4 vzorky. Děti s chromozomálními abnormalitami budou rovněž ze studie vyloučeny.