Une étude longitudinale pour analyser la corrélation entre le CAI et la bilirubine

Chez les nouveau-nés, l'hémolyse intravasculaire peut varier de légère, dans le cadre du renouvellement physiologique des globules rouges, à sévère dans des cas tels que la jaunisse ou l'incompatibilité ABO. Des biomarqueurs précoces de l'hémolyse permettraient d'améliorer la pratique de la néonatologie en identifiant les patients à risque, en particulier si le dosage est simple, rapide, non invasif et quantitatif. Notre essai URICA, maintenant terminé, sur des bébés mâles nés à terme (enregistrement d'essai CPMS 19576) a montré que la petite protéine cytoplasmique anhydrase carbonique I (CAI), présente en abondance dans les globules rouges, était détectée (par dosage immunologique et spectrométrie de masse), dans 17 échantillons d'urine sur 26 ont été prélevés une fois par bébé recruté au service de néonatologie. Des échantillons CAI-positifs ont été obtenus à partir de bébés dont les taux de bilirubine augmentent rapidement ou culminent au-dessus du seuil de photothérapie. L'urine CAI-négative a été obtenue lorsque la bilirubine n'a pas atteint le seuil de la photothérapie ou après avoir récupéré de son pic. À quatre reprises, la cause de l'urine CAI-positive était indéterminée (https://doi.org/10.1093/jalm/jfaa051). Étant donné que le CAI est normalement absent de l'urine, un signal positif indique une hémolyse intravasculaire et confirme que le CAI a traversé la barrière glomérulaire. Cependant, la puissance quantitative du CAI urinaire pour prédire et estimer une crise hémolytique imminente nécessite une nouvelle étude longitudinale, qui est l'objectif de l'essai URICA-II.

Justification clinique : La santé des nouveau-nés doit être surveillée régulièrement pour l'une des nombreuses affections évoluant rapidement et potentiellement mortelles qui impliquent une hémolyse intravasculaire. Ceux-ci incluent la septicémie (par ex. bactéries Gram-positives), infection protozoaire (par ex. paludisme), allo-immunité (incompatibilité ABO et Rhésus), traits génétiques (par ex. drépanocytose, déficit en glucose-6-phosphate déshydrogénase [G6PD]) ou déséquilibre électrolytique. Certaines de ces conditions (par ex. RhD, G6PD, trait drépanocytaire) sont particulièrement répandus dans les groupes ethniques minoritaires [1-4]. Dans les établissements de santé avancés, les tests d'hémolyse consistent à prélever des échantillons de sang pour des analyses microscopiques (par ex. numération cellulaire et morphologie) ou des dosages biochimiques (par exemple pour la bilirubine non conjuguée ou la lactate déshydrogénase). D'autres tests gourmands en ressources sont disponibles pour diagnostiquer des causes spécifiques d'hémolyse, telles que l'anémie hémolytique auto-immune avec test de Coombs ou le déficit en G6PD par des tests redox. Ces tests nécessitent un personnel qualifié, un équipement de laboratoire de pointe et des normes d'hygiène élevées. Des tests plus simples, moins chers et plus rapides sur de nouveaux biomarqueurs de la maladie, adaptés aux conditions de point de service et de laboratoire minimal, seraient médicalement et économiquement justifiés. Cette technologie profiterait également au monde en développement, où l'hémolyse peut être plus courante.

Contexte scientifique : L'enzyme soluble anhydrase carbonique I (CAI) est, après les isoformes de l'hémoglobine, la protéine la plus abondante dans le cytoplasme des globules rouges [5]. Le plasma ne contient normalement que des traces de CAI, mais les niveaux augmentent lors de l'hémolyse [6]. Sur la base de sa petite taille (29 kDa et rayon de Stokes 25 Å [7-9], le CAI devrait filtrer à travers la barrière glomérulaire et apparaître dans l'urine [10]. Les immuno-techniques quantitatives peuvent détecter le CAI même à une dilution de 1:10 000. L'urine d'adultes en bonne santé est normalement dépourvue de CAI, produisant un signal de fond très faible. On s'attend à ce que l'excrétion urinaire de CAI soit proportionnelle à l'étendue de l'hémolyse et serve donc de biomarqueur quantitatif qui peut être dosé de manière non invasive.

Objectifs du (premier) essai URICA : L'objectif de l'essai URICA (excrétion URInaire de l'anhydrase carbonique ; enregistrement de l'essai CPMS 19576) maintenant terminé était de tester la présence d'isoformes CA dans l'urine des nouveau-nés à terme admis à Evelina's Children Hôpital. La cohorte comprenait des témoins non suspectés de subir une hémolyse (au-delà de la forme physiologique légère) ainsi que des bébés présentant une incompatibilité ABO, une anémie et un traitement contre la jaunisse. L'essai URICA a obtenu l'approbation éthique le 12 mai 2015 (REC : 15/NS/0042). La collecte et l'analyse des échantillons ont été achevées en juin 2017. Mesures sur l'urine composées de Western blot pour CAI (une méthode sensible mais semi-quantitative), ELISA pour CAI (une méthode quantitative pour déterminer les niveaux de CAI), spec de masse pour obtenir le protéome de l'urine, ainsi que des mesures de protéines totales et de créatinine ( pour évaluer les preuves d'insuffisance rénale comme critère d'exclusion). En outre, des données cliniques ont été recueillies sur la gestation, l'hémoglobine sanguine, la bilirubine sérique ou transcutanée et la protéine C-réactive à plusieurs moments, dans la mesure du possible, pour tester respectivement l'anémie, la jaunisse et l'infection. 26 bébés ont été recrutés.

Résultats de l'essai URICA : le transfert Western n'a montré aucun signal CAI détectable dans 9 échantillons (indiscernable du signal de fond dans l'urine adulte) et une gamme de signaux positifs dans 17 échantillons. Ces résultats ont été étayés par des mesures ELISA. Deux échantillons avaient des niveaux élevés de protéines/créatinine, indiquant peut-être des lésions rénales, mais ceux-ci n'ont pas produit d'urine positive pour le CAI. L'analyse par spectrométrie de masse a montré que le niveau de CAI n'était corrélé à aucune autre protéine de globule rouge, ce qui indique fortement que l'hémolyse s'était produite à l'intérieur des vaisseaux et non dans les voies urinaires (où elle conduirait également à des signaux provenant par ex. hémoglobine ou échangeur d'anions 1). Par rapport à l'urine CAI-négative, la protéine la plus surabondante dans les échantillons CAI-positifs était, en fait, CAI, plaidant pour l'excellent pouvoir de résolution de ce biomarqueur. Lorsque l'on considère le moment auquel l'urine a été collectée, il est possible d'expliquer le signal CAI par rapport aux mesures de bilirubine comme suit :

• Six bébés avec des niveaux de bilirubine inférieurs au seuil (directives du NHS pour la photothérapie) ont produit une urine CAI négative ;
• Chez seize bébés dont les taux de bilirubine augmentaient rapidement et de manière significative (dont 14 ont reçu une photothérapie), le signal CAI était le plus fort dans les échantillons d'urine prélevés plus près du pic de bilirubine, avec une tendance à suggérer que le pic de CAI précédait le pic de bilirubine ;
• Quatre bébés ont produit de l'urine avec un signal CAI très fort mais n'ont pas manifesté de bilirubine élevée, arguant qu'un mécanisme distinct produit l'hémolyse.

Hypothèses : Nous proposons que le CAI urinaire est un biomarqueur de l'hémolyse, et nous émettons l'hypothèse que :

1. Le signal CAI urinaire peut être stratifié pour se rapporter à l'état hémolytique sous-jacent :

   • indétectable : n'indique aucun signe d'hémolyse ;
   • intermédiaire : niveaux indiquant une hémolyse chez les bébés atteints de jaunisse ;
   • seuil supérieur : indiquant une crise hémolytique aiguë qui peut ne pas provoquer d'élévation de la bilirubine.
2. Dans la gamme intermédiaire, un signal CAI urinaire positif précède le pic de bilirubine et est un indicateur précoce d'ictère.

5 Objectifs et but de l'essai

L'évolution temporelle de la bilirubine est actuellement utilisée pour évaluer la santé néonatale, mais nous proposons que la surveillance urinaire du CAI fournirait un signe d'alerte précoce pour identifier les patients à risque et permettre ainsi aux services de néonatologie de mieux rationaliser leurs ressources. Pour établir l'utilité de ce biomarqueur, nous proposons d'entreprendre une étude longitudinale sur une cohorte de bébés nés à terme afin de corréler les évolutions temporelles de l'IAC urinaire avec la bilirubine (pour tester l'hypothèse 2) et d'obtenir des informations cliniques susceptibles de déterminer la cause. et l'étendue de l'hémolyse (pour informer les niveaux de seuil pour l'hypothèse 1).

Plan de recherche : Il y a 9 000 naissances par an à St Thomas'. Parmi ceux-ci, environ 1 000 bébés sont admis à l'unité néonatale de soins intensifs (USIN) chaque année ; environ la moitié de ces bébés naissent à terme. Environ 300 personnes auront un ictère nécessitant une photothérapie et environ 10 à 20 personnes auront une hémolyse sévère (typiquement une incompatibilité ABO). L'objectif est de recruter 30 bébés nés à terme, sur une période ne dépassant pas 24 mois, qui devraient rester dans l'unité néonatale pendant au moins cinq jours et jusqu'à 10 jours au cours desquels des échantillons d'urine seront prélevés aussi régulièrement que possible. (une fois par jour ; si ce n'est pas possible, au moins une fois tous les deux jours), horodatées et stockées dans un congélateur dédié pour une analyse hors ligne à Oxford, une fois le recrutement terminé. Lorsque cela est possible à proximité du point de collecte, un petit volume d'urine (pas plus de quatre gouttelettes) sera pipeté sur un dispositif à flux latéral (LFD), fourni dans le cadre d'un kit, pour obtenir une lecture instantanée de l'immunoréactivité CAI . Le LFD doit être étiqueté avec l'identifiant d'urine correspondant et enregistré (positif/négatif/vide). Si cela n'est pas faisable près du point de collecte, cette étape sera effectuée plus tard, à Oxford, sur des échantillons décongelés. Dans les 6 heures suivant l'échantillon d'urine, un taux de bilirubine transcutanée non invasif sera obtenu et enregistré. Ces données seront complétées par les informations suivantes, obtenues dans le cadre de la pratique clinique normale sans rapport avec les objectifs de l'essai.

• Bilirubine sérique prélevée systématiquement
• Hémoglobine sanguine et formule sanguine complète
• Protéine C-réactive (CRP) et fonction rénale
• L'âge gestationnel;
• Durée et moment de la photothérapie
• Poids à la naissance
• Sexe
• Résultat du test direct de Combes ;
• Raison de l'admission à l'USIN.

Les échantillons d'urine seront analysés à Oxford en termes de :

• Immunoréactivité CAI sur western blot, une méthode semi-quantitative très sensible ;
• Immunoréactivité CAI par ELISA, une méthode quantitative;
• Protéines totales et créatinine comme marqueurs de lésions rénales ;
• Osmolarité, pour déterminer l'état diurétique. Tous les échantillons seront anonymisés avec un code alphanumérique et liés aux données cliniques. Les bébés dont moins de 4 échantillons d'urine sont obtenus seront exclus de l'étude au motif que ces ensembles de données n'auraient pas le pouvoir de résolution pour tester les hypothèses. Le recrutement sera terminé lorsque 30 bébés avec au moins 4 échantillons auront été recrutés. Les bébés présentant des anomalies chromosomiques seront également exclus de l'étude.