Un estudio longitudinal para analizar la correlación entre CAI y bilirrubina

En los recién nacidos, la hemólisis intravascular puede variar de leve, como parte del recambio fisiológico de los glóbulos rojos, a grave en casos como ictericia o incompatibilidad ABO. Los primeros biomarcadores de hemólisis mejorarían la práctica de la neonatología al identificar a los pacientes en riesgo, particularmente si el ensayo es simple, rápido, no invasivo y cuantitativo. Nuestro ensayo URICA ahora finalizado en bebés varones nacidos a término (registro de ensayo CPMS 19576) mostró que la pequeña proteína citoplasmática anhidrasa carbónica I (CAI), que se encuentra abundantemente en los glóbulos rojos, se detectó (mediante inmunoensayo y espectrometría de masas), en 17 de 26 muestras de orina recolectadas una vez por bebé reclutado en la sala de neonatología. Las muestras positivas para CAI se obtuvieron de bebés con niveles de bilirrubina que aumentan rápidamente o superan el umbral de la fototerapia. Se obtuvo orina negativa para CAI cuando la bilirrubina no alcanzó el umbral de fototerapia o después de que se había recuperado de su punto máximo. En cuatro ocasiones no se determinó la causa de la orina CAI positiva (https://doi.org/10.1093/jalm/jfaa051). Dado que CAI normalmente está ausente de la orina, una señal positiva indica hemólisis intravascular y confirma que CAI cruzó la barrera glomerular. Sin embargo, el poder cuantitativo del CAI urinario para predecir y estimar una crisis hemolítica inminente requiere un nuevo estudio longitudinal, que es el objetivo del ensayo URICA-II.

Justificación clínica: la salud de los recién nacidos debe controlarse con regularidad para detectar una de las muchas afecciones que progresan rápidamente y que pueden poner en peligro la vida y que implican hemólisis intravascular. Estos incluyen sepsis (p. bacterias grampositivas), infección por protozoos (p. paludismo), aloinmunidad (incompatibilidad ABO y Rhesus), rasgos genéticos (p. células falciformes, deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa [G6PD]) o desequilibrio electrolítico. Algunas de estas condiciones (p. RhD, G6PD, rasgo drepanocítico) son particularmente prevalentes en grupos étnicos minoritarios [1-4]. En los centros de salud avanzados, las pruebas de hemólisis implican tomar muestras de sangre para análisis microscópicos (p. recuento celular y morfología) o ensayos bioquímicos (p. ej., para bilirrubina no conjugada o lactato deshidrogenasa). Hay disponibles otras pruebas que requieren muchos recursos para diagnosticar causas específicas de hemólisis, como la anemia hemolítica autoinmune con la prueba de Coombs o la deficiencia de G6PD mediante ensayos redox. Estas pruebas requieren personal capacitado, equipo de laboratorio avanzado y altos estándares de higiene. Se justificarían médica y económicamente pruebas más sencillas, baratas y rápidas sobre nuevos biomarcadores de enfermedades, adaptadas a las condiciones mínimas de laboratorio en el punto de atención. Esta tecnología también beneficiaría al mundo en desarrollo, donde la hemólisis puede ser más común.

Antecedentes científicos: La enzima soluble anhidrasa carbónica I (CAI) es, después de las isoformas de hemoglobina, la proteína más abundante en el citoplasma de los glóbulos rojos [5]. El plasma normalmente contiene solo cantidades mínimas de CAI, pero los niveles aumentarán con la hemólisis [6]. En base a su pequeño tamaño (29 kDa y radio de Stokes 25 Å [7-9], se prevé que el CAI se filtre a través de la barrera glomerular y aparezca en la orina [10]. Las inmunotécnicas cuantitativas pueden detectar CAI incluso a una dilución de 1:10.000. La orina de adultos sanos normalmente carece de CAI, lo que produce una señal de fondo muy baja. Se espera que la excreción urinaria de CAI sea proporcional al grado de hemólisis y, por lo tanto, sirva como un biomarcador cuantitativo que se puede analizar de forma no invasiva.

Objetivos del (primer) ensayo URICA: El objetivo del ensayo URICA (excreción urinaria de anhidrasa carbónica; registro de ensayo CPMS 19576), ahora finalizado, era evaluar la presencia de isoformas de CA en la orina de recién nacidos a término ingresados ​​en Evelina's Children. Hospital. La cohorte incluía controles de los que no se sospechaba que sufrían hemólisis (más allá de la forma fisiológica leve), así como bebés con incompatibilidad ABO, anemia y en tratamiento por ictericia. El ensayo URICA obtuvo la aprobación ética el 12 de mayo de 2015 (REC: 15/NS/0042). La recolección y análisis de muestras se completó en junio de 2017. Mediciones en orina compuestas de transferencia Western para CAI (un método sensible pero semicuantitativo), ELISA para CAI (un método cuantitativo para determinar los niveles de CAI), espectrometría de masas para obtener el proteoma de la orina, además de mediciones de proteína total y creatinina ( para evaluar la evidencia de insuficiencia renal como criterio de exclusión). Además, se recogieron datos clínicos sobre la gestación y la hemoglobina en sangre, la bilirrubina sérica o transcutánea y la proteína C reactiva en varios momentos, cuando fue posible, para detectar anemia, ictericia e infección, respectivamente. Se reclutaron 26 bebés.

Resultados del ensayo URICA: la transferencia de Western no mostró ninguna señal CAI detectable en 9 muestras (indistinguible de la señal de fondo en la orina adulta) y un rango de señales positivas en 17 muestras. Estos resultados fueron respaldados por mediciones ELISA. Dos muestras tenían niveles elevados de proteína/creatinina, lo que posiblemente indica daño renal, pero no produjeron orina positiva para CAI. El análisis de espectrometría de masas mostró que el nivel de CAI no se correlacionó con ninguna otra proteína de glóbulos rojos, lo que indica fuertemente que la hemólisis se había producido dentro de los vasos y no en el tracto urinario (donde también daría lugar a señales de, p. hemoglobina o intercambiador de aniones 1). En comparación con la orina CAI negativa, la proteína más sobreabundante en las muestras CAI positivas fue, de hecho, CAI, lo que justifica el excelente poder de resolución de este biomarcador. Al considerar el punto de tiempo en el que se recolectó la orina, es posible explicar la señal CAI en relación con las mediciones de bilirrubina de la siguiente manera:

• Seis bebés con niveles de bilirrubina por debajo del umbral (directrices del NHS para fototerapia) produjeron orina negativa para CAI;
• En dieciséis bebés con niveles de bilirrubina en aumento rápido y significativo (14 de los cuales recibieron fototerapia), la señal de CAI fue más fuerte en las muestras de orina que se recolectaron más cerca del pico de bilirrubina, con una tendencia a sugerir que el pico de CAI precedió al pico de bilirrubina;
• Cuatro bebés produjeron orina con una señal CAI muy fuerte pero no manifestaron bilirrubina elevada, lo que argumenta que un mecanismo distinto está produciendo hemólisis.

Hipótesis: Proponemos que el CAI urinario es un biomarcador de hemólisis, y planteamos la hipótesis de que:

1. La señal urinaria de CAI se puede estratificar para relacionarla con el estado hemolítico subyacente:

   • indetectable: indica que no hay evidencia de hemólisis;
   • intermedio: niveles que indican hemólisis en bebés con ictericia;
   • Umbral más alto: indica una crisis hemolítica aguda que puede no provocar un aumento de la bilirrubina.
2. En el rango intermedio, una señal CAI urinaria positiva precede al pico de bilirrubina y es un indicador temprano de ictericia.

5 Objetivos y finalidad del ensayo

El curso temporal de la bilirrubina se utiliza actualmente para medir la salud neonatal, pero proponemos que la monitorización del CAI urinario proporcione una señal de alerta temprana para identificar a los pacientes en riesgo y, por lo tanto, permitir que las salas neonatales racionalicen mejor sus recursos. Para establecer la utilidad de este biomarcador, proponemos realizar un estudio longitudinal en una cohorte de bebés nacidos a término para correlacionar la evolución temporal del CAI urinario con la bilirrubina (para probar la hipótesis 2) y obtener información clínica que pueda determinar la causa. y extensión de la hemólisis (para informar los niveles de umbral para la hipótesis 1).

Plan de investigación: Hay 9.000 nacimientos al año en St Thomas'. De estos, ~1000 bebés ingresan en la Unidad de Cuidados Intensivos Neonatales (UCIN) cada año; aproximadamente la mitad de estos bebés nacen a término. Unos ~300 tendrán ictericia que requerirá fototerapia y ~10-20 tendrán hemólisis severa (típicamente incompatibilidad ABO). El objetivo es reclutar 30 bebés a término, en un período no mayor a 24 meses, que se espera que permanezcan en la unidad neonatal durante al menos cinco días y hasta 10 días durante los cuales se obtendrán muestras de orina con la mayor regularidad posible. (una vez al día; si no es posible, al menos una vez cada dos días), con sello de tiempo y almacenado en un congelador dedicado para análisis fuera de línea en Oxford, una vez que se completa el reclutamiento. Cuando sea posible realizarlo cerca del punto de recolección, se pipeteará un pequeño volumen de orina (no más de cuatro gotas) en un dispositivo de flujo lateral (LFD), que se proporciona como parte de un kit, para obtener una lectura instantánea de la inmunorreactividad de CAI. . El LFD se etiquetará con el identificador de orina correspondiente y se registrará (positivo/negativo/vacío). Si no es factible cerca del punto de recolección, este paso se realizará más tarde, en Oxford, en muestras descongeladas. Dentro de las 6 horas posteriores a la muestra de orina, se obtendrá y registrará un nivel de bilirrubina transcutánea no invasivo. Estos datos se complementarán con la siguiente información, obtenida como parte de la práctica clínica habitual ajena a los objetivos del ensayo.

• Bilirrubina sérica donde se recolecta de forma rutinaria
• Hemoglobina en sangre y hemograma completo
• Proteína C reactiva (PCR) y función renal
• Edad gestacional;
• Duración y momento de la fototerapia
• Peso de nacimiento
• Sexo
• Resultado de la prueba de Coombs directa;
• Motivo de ingreso en la UCIN.

Las muestras de orina se analizarán en Oxford en términos de:

• inmunorreactividad CAI en western blot, un método semicuantitativo de alta sensibilidad;
• inmunoreactividad CAI por ELISA, un método cuantitativo;
• proteína total y creatinina como marcadores de daño renal;
• Osmolaridad, para determinar el estado diurético. Todas las muestras se anonimizarán con un código alfanumérico y se vincularán a los datos clínicos. Los bebés de los que se obtengan menos de 4 muestras de orina serán excluidos del estudio sobre la base de que dichos conjuntos de datos no tendrían el poder de resolución para probar las hipótesis. El reclutamiento se completará cuando se hayan reclutado 30 bebés con al menos 4 muestras. Los bebés con anomalías cromosómicas también serán excluidos del estudio.