Uno studio longitudinale per analizzare la correlazione tra CAI e bilirubina

Nei neonati, l'emolisi intravascolare può variare da lieve, come parte del turnover fisiologico dei globuli rossi, a grave in casi come l'ittero o l'incompatibilità ABO. I primi biomarcatori dell'emolisi migliorerebbero la pratica neonatologica identificando i pazienti a rischio, in particolare se il test è semplice, rapido, non invasivo e quantitativo. Il nostro studio URICA ora completato su neonati maschi a termine (registrazione dello studio CPMS 19576) ha mostrato che la piccola proteina citoplasmatica anidrasi carbonica I (CAI), che si trova abbondantemente nei globuli rossi, è stata rilevata (mediante test immunologico e massa-spec), in 17 campioni di urina su 26 raccolti una volta per bambino reclutato nel reparto di neonatologia. I campioni CAI-positivi sono stati ottenuti da bambini con livelli di bilirubina che stanno rapidamente aumentando o raggiungendo un picco al di sopra della soglia per la fototerapia. L'urina CAI-negativa è stata ottenuta quando la bilirubina non ha raggiunto la soglia della fototerapia o dopo che si era ripresa dal suo picco. In quattro occasioni, la causa dell'urina CAI-positiva era indeterminata (https://doi.org/10.1093/jalm/jfaa051). Poiché il CAI è normalmente assente dalle urine, un segnale positivo è indicativo di emolisi intravascolare e conferma che il CAI ha attraversato la barriera glomerulare. Tuttavia, il potere quantitativo del CAI urinario di prevedere e stimare una crisi emolitica imminente richiede un nuovo studio longitudinale, che è l'obiettivo dello studio URICA-II.

Razionale clinico: la salute dei neonati deve essere monitorata regolarmente per una delle molte condizioni in rapida progressione e potenzialmente pericolose per la vita che implicano l'emolisi intravascolare. Questi includono la sepsi (ad es. batteri Gram-positivi), infezione da protozoi (ad es. malaria), alloimmunità (incompatibilità ABO e Rhesus), caratteri genetici (es. carenza di cellule falciformi, glucosio-6-fosfato deidrogenasi [G6PD]) o squilibrio elettrolitico. Alcune di queste condizioni (es. RhD, G6PD, tratto falciforme) sono particolarmente diffusi nei gruppi etnici minoritari [1-4]. Nelle strutture sanitarie avanzate, i test per l'emolisi prevedono il prelievo di campioni di sangue per analisi microscopiche (ad es. conta cellulare e morfologia) o analisi biochimiche (ad es. per bilirubina non coniugata o lattato deidrogenasi). Sono disponibili altri test ad alta intensità di risorse per diagnosticare cause specifiche di emolisi, come l'anemia emolitica autoimmune con test di Coombs o il deficit di G6PD mediante test redox. Questi test richiedono personale addestrato, attrezzature di laboratorio avanzate ed elevati standard di igiene. Test più semplici, più economici e più veloci su nuovi biomarcatori di malattia, adattati per condizioni minime di laboratorio presso il punto di cura, sarebbero giustificati dal punto di vista medico ed economico. Questa tecnologia andrebbe anche a vantaggio del mondo in via di sviluppo, dove l'emolisi può essere più comune.

Background scientifico: L'enzima solubile anidrasi carbonica I (CAI) è, dopo le isoforme dell'emoglobina, la proteina più abbondante nel citoplasma dei globuli rossi [5]. Il plasma normalmente contiene solo tracce di CAI, ma i livelli aumentano con l'emolisi [6]. Sulla base delle sue piccole dimensioni (29 kDa e raggio di Stokes 25 Å [7-9] si prevede che il CAI filtri attraverso la barriera glomerulare e appaia nelle urine [10]. Le immunotecniche quantitative possono rilevare CAI anche alla diluizione 1:10.000. L'urina di adulti sani è normalmente priva di CAI, producendo un segnale di fondo molto basso. Si prevede che l'escrezione urinaria di CAI sia proporzionale all'entità dell'emolisi e quindi funga da biomarcatore quantitativo che può essere analizzato in modo non invasivo.

Obiettivi del (primo) studio URICA: L'obiettivo dell'ormai completato studio URICA (URIinary excretion of Carbonic Anhydrase; registrazione dello studio CPMS 19576) era testare la presenza di isoforme di CA nelle urine di neonati a termine ricoverati presso l'Evelina's Children Ospedale. La coorte includeva controlli che non erano sospettati di subire emolisi (oltre la forma fisiologica lieve) così come bambini con incompatibilità ABO, anemia e sottoposti a trattamento per ittero. Lo studio URICA ha ottenuto l'approvazione etica il 12 maggio 2015 (REC: 15/NS/0042). La raccolta e l'analisi dei campioni è stata completata entro giugno 2017. Le misurazioni sulle urine comprendevano western blotting per CAI (un metodo sensibile ma semi-quantitativo), ELISA per CAI (un metodo quantitativo per determinare i livelli di CAI), mass-spec per ottenere il proteoma dell'urina, oltre a misurazioni di proteine ​​totali e creatinina ( valutare l'evidenza di insufficienza renale come criterio di esclusione). Inoltre, sono stati raccolti dati clinici sulla gestazione e sull'emoglobina nel sangue, sulla bilirubina sierica o transcutanea e sulla proteina C-reattiva in diversi momenti, ove possibile, per testare rispettivamente anemia, ittero e infezione. Sono stati reclutati 26 bambini.

Risultati dello studio URICA: il Western blotting non ha mostrato alcun segnale CAI rilevabile in 9 campioni (indistinguibile dal segnale di fondo nelle urine degli adulti) e una serie di segnali positivi in ​​17 campioni. Questi risultati sono stati supportati da misurazioni ELISA. Due campioni presentavano livelli elevati di proteine/creatinina, probabilmente indicativi di danno renale, ma questi non producevano urina CAI-positiva. L'analisi delle specifiche di massa ha mostrato che il livello di CAI non era correlato con nessun'altra proteina dei globuli rossi, indicando fortemente che l'emolisi si era verificata all'interno dei vasi e non nel tratto urinario (dove avrebbe anche portato a segnali ad es. emoglobina o scambiatore anionico 1). Rispetto all'urina CAI-negativa, la proteina più abbondante nei campioni CAI-positivi era, infatti, CAI, sostenendo l'eccellente potere risolutivo di questo biomarcatore. Quando si considera il momento in cui è stata raccolta l'urina, è possibile spiegare il segnale CAI relativo alle misurazioni della bilirubina come segue:

• Sei bambini con livelli di bilirubina sottosoglia (linee guida NHS per la fototerapia) hanno prodotto urine CAI-negative;
• In sedici neonati con livelli di bilirubina in rapido e significativo aumento (14 dei quali sottoposti a fototerapia), il segnale CAI era più forte nei campioni di urina raccolti più vicino al picco di bilirubina, con una tendenza a suggerire che il picco CAI precedesse il picco di bilirubina;
• Quattro bambini hanno prodotto urina con un segnale CAI molto forte ma non hanno manifestato bilirubina elevata, sostenendo che un meccanismo distinto sta producendo emolisi.

Ipotesi: proponiamo che il CAI urinario sia un biomarcatore di emolisi e ipotizziamo che:

1. Il segnale CAI urinario può essere stratificato in relazione allo stato emolitico sottostante:

   • non rilevabile: indica nessuna evidenza di emolisi;
   • intermedio: livelli che indicano emolisi nei neonati itterici;
   • soglia più alta: indica una crisi emolitica acuta che potrebbe non provocare un aumento della bilirubina.
2. Nel range intermedio, un segnale CAI urinario positivo precede il picco della bilirubina ed è un indicatore precoce di ittero.

5 Obiettivi e finalità della sperimentazione

L'andamento temporale della bilirubina è attualmente utilizzato per misurare la salute neonatale, ma proponiamo che il monitoraggio CAI urinario fornisca un segnale di allarme precoce per identificare i pazienti a rischio e consentire così ai reparti neonatali di razionalizzare meglio le proprie risorse. Per stabilire l'utilità di questo biomarcatore, proponiamo di intraprendere uno studio longitudinale su una coorte di neonati a termine per correlare i decorsi temporali del CAI urinario con la bilirubina (per verificare l'ipotesi 2) e per ottenere informazioni cliniche che possano determinare la causa e l'entità dell'emolisi (per informare i livelli di soglia per l'ipotesi 1).

Piano di ricerca: Ci sono 9.000 nascite all'anno al St Thomas'. Di questi, circa 1000 bambini vengono ricoverati ogni anno presso l'Unità di Terapia Intensiva Neonatale (NICU); circa la metà di questi bambini nasce a termine. Circa ~300 avranno ittero che necessita di fototerapia e ~10-20 avranno una grave emolisi (tipicamente incompatibilità ABO). L'obiettivo è reclutare 30 bambini a termine, per un periodo non superiore a 24 mesi, che dovrebbero rimanere nell'unità neonatale per almeno cinque giorni e fino a 10 giorni durante i quali verranno prelevati campioni di urina il più regolarmente possibile (una volta al giorno; se non possibile, almeno una volta ogni due giorni), contrassegnato con data e ora e conservato in un congelatore dedicato per l'analisi off-line a Oxford, una volta completato il reclutamento. Quando possibile eseguire vicino al punto di raccolta, un piccolo volume di urina (non più di quattro goccioline) verrà pipettato su un dispositivo a flusso laterale (LFD), fornito come parte di un kit, per ottenere una lettura istantanea dell'immunoreattività CAI . L'LFD deve essere etichettato con l'identificatore di urina corrispondente e registrato (positivo/negativo/vuoto). Se non fattibile vicino al punto di raccolta, questo passaggio verrà eseguito successivamente, a Oxford, su campioni scongelati. Entro 6 ore dal campione di urina, sarà ottenuto e registrato un livello di bilirubina transcutanea non invasivo. Questi dati saranno integrati con le seguenti informazioni, ottenute nell'ambito della normale pratica clinica non correlata agli obiettivi della sperimentazione.

• La bilirubina sierica è stata raccolta di routine
• Emoglobina nel sangue ed emocromo completo
• Proteina C-reattiva (PCR) e funzione renale
• età gestazionale;
• Durata e timing della fototerapia
• Peso alla nascita
• Sesso
• Risultato del test diretto di Coombs;
• Motivo del ricovero in terapia intensiva neonatale.

I campioni di urina saranno analizzati a Oxford in termini di:

• immunoreattività CAI su western blot, un metodo semiquantitativo altamente sensibile;
• immunoreattività CAI mediante ELISA, un metodo quantitativo;
• Proteine ​​totali e creatinina come marcatori di danno renale;
• Osmolarità, per determinare lo stato diuretico. Tutti i campioni saranno anonimizzati con un codice alfanumerico e collegati ai dati clinici. I bambini dai quali si ottengono meno di 4 campioni di urina saranno esclusi dallo studio sulla base del fatto che tali set di dati non avrebbero il potere risolutivo per verificare le ipotesi. Il reclutamento sarà completato quando saranno stati reclutati 30 bambini con almeno 4 campioni. Saranno esclusi dallo studio anche i bambini con anomalie cromosomiche.