Pitkittäinen tutkimus CAI:n ja bilirubiinin välisen korrelaation analysoimiseksi

Vastasyntyneillä intravaskulaarinen hemolyysi voi vaihdella lievästä, osana punasolujen fysiologista kiertoa, vaikeaan tapauksiin, kuten keltatautiin tai ABO-yhteensopimattomuuteen. Hemolyysin varhaiset biomarkkerit parantaisivat neonatologian käytäntöä tunnistamalla riskipotilaat, erityisesti jos määritys on yksinkertainen, nopea, ei-invasiivinen ja kvantitatiivinen. Nyt päättynyt URICA-tutkimuksemme täysiaikaisilla urosvauvoilla (kokeilurekisteröinti CPMS 19576) osoitti, että pieni sytoplasminen hiilihappoanhydraasi I (CAI), jota esiintyy runsaasti punasoluissa, havaittiin (immunologisella ja massaspesifikalla) Neonatologian osastolla 17 26 virtsanäytteestä kerättiin kerran per värvätty vauva. CAI-positiiviset näytteet saatiin vauvoista, joiden bilirubiinitasot nousevat nopeasti tai ovat huipussaan valohoidon kynnyksen yläpuolella. CAI-negatiivinen virtsa saatiin, kun jompikumpi bilirubiini ei saavuttanut valohoitokynnystä tai kun se oli toipunut huippustaan. Neljässä tapauksessa CAI-positiivisen virtsan syy oli epäselvä (https://doi.org/10.1093/jalm/jfaa051). Koska CAI ei normaalisti esiinny virtsasta, positiivinen signaali viittaa intravaskulaariseen hemolyysiin ja vahvistaa, että CAI ylitti glomerulaarisen esteen. Virtsan CAI:n määrällinen kyky ennustaa ja arvioida uhkaava hemolyyttinen kriisi edellyttää kuitenkin uutta pitkittäistutkimusta, joka on URICA-II-tutkimuksen tavoitteena.

Kliininen perustelu: Vastasyntyneiden terveyttä on seurattava säännöllisesti yhden nopeasti etenevän ja mahdollisesti hengenvaarallisen sairauden varalta, joka liittyy intravaskulaariseen hemolyysiin. Näitä ovat sepsis (esim. grampositiiviset bakteerit), alkueläininfektio (esim. malaria), alloimmuniteetti (ABO ja Rhesus-yhteensopimattomuus), geneettiset ominaisuudet (esim. sirppisolu, glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin [G6PD] puutos) tai elektrolyyttitasapainon häiriö. Jotkut näistä ehdoista (esim. RhD, G6PD, sirppipiirre) ovat erityisen yleisiä vähemmistöetnisissä ryhmissä [1-4]. Kehittyneissä terveydenhuollon laitoksissa hemolyysikokeisiin kuuluu verinäytteiden ottaminen mikroskooppianalyysejä varten (esim. solujen lukumäärä ja morfologia) tai biokemiallisia määrityksiä (esim. konjugoimattoman bilirubiinin tai laktaattidehydrogenaasin määrittämiseksi). Muita resurssiintensiivisiä testejä on saatavilla hemolyysin erityisten syiden diagnosoimiseksi, kuten autoimmuuni hemolyyttinen anemia Coombs-testillä tai G6PD-puutos redox-määrityksillä. Nämä testit vaativat koulutettua henkilökuntaa, kehittyneitä laboratoriolaitteita ja korkeita hygieniastandardeja. Yksinkertaisemmat, halvemmat ja nopeammat testit uusilla taudin biomarkkereilla, jotka on mukautettu hoitopisteisiin, minimaalisiin laboratorioolosuhteisiin, olisivat lääketieteellisesti ja taloudellisesti perusteltuja. Tämä tekniikka hyödyttäisi myös kehitysmaita, joissa hemolyysi voi olla yleisempää.

Tieteellinen tausta: Liukoinen entsyymi hiilihappoanhydraasi I (CAI) on hemoglobiinin isoformien jälkeen runsain proteiini punasolujen sytoplasmassa [5]. Plasma sisältää normaalisti vain pieniä määriä CAI:ta, mutta tasot nousevat hemolyysin aikana [6]. Pienen kokonsa (29 kDa ja Stokes-säde 25 Å [7-9]) perusteella CAI:n ennustetaan suodattuvan glomerulaarisen esteen läpi ja ilmestyvän virtsaan [10]. Kvantitatiiviset immunotekniikat voivat havaita CAI:n jopa 1:10 000 laimennuksella. Terveiden aikuisten virtsassa ei yleensä ole CAI:ta, mikä tuottaa erittäin alhaisen taustasignaalin. Virtsan CAI:n erittymisen odotetaan olevan verrannollinen hemolyysin laajuuteen, ja siksi se toimii kvantitatiivisena biomarkkerina, joka voidaan määrittää ei-invasiivisesti.

(Ensimmäisen) URICA-tutkimuksen tavoitteet: Nyt valmistuneen URICA-tutkimuksen (hiilianhydraasin erittyminen virtsaan; tutkimusrekisteröinti CPMS 19576) tavoitteena oli testata CA-isoformien esiintymistä Evelinan lapsiin otettujen täysiaikaisten vastasyntyneiden virtsassa. Sairaala. Kohorttiin kuului kontrolleja, joiden ei epäilty saaneen hemolyysiä (lievän fysiologisen muodon lisäksi), sekä vauvoja, joilla oli ABO-yhteensopimattomuus, anemiaa ja keltatautihoitoa. URICA-tutkimus sai eettisen hyväksynnän 12. toukokuuta 2015 (REC: 15/NS/0042). Näytteiden keräys ja analysointi saatiin päätökseen kesäkuuhun 2017 mennessä. Virtsan mittaukset käsittivät Western blot -testin CAI:lle (herkkä mutta puolikvantitatiivinen menetelmä), ELISA:sta CAI:lle (kvantitatiivinen menetelmä CAI-tasojen määrittämiseksi), massaspesifikaation virtsan proteomin saamiseksi sekä kokonaisproteiinin ja kreatiniinin mittauksista ( arvioida todisteita munuaisten vajaatoiminnasta poissulkemiskriteerinä). Lisäksi kerättiin kliinisiä tietoja raskaudesta ja veren hemoglobiinista, seerumista tai transkutaanisesta bilirubiinista ja C-reaktiivisesta proteiinista useissa aikapisteissä, mikäli mahdollista, anemian, keltaisuuden ja infektion testaamiseksi. Rekrytoitiin 26 vauvaa.

URICA-tutkimuksen tulokset: Western blotting ei osoittanut havaittavaa CAI-signaalia 9 näytteessä (ei erottuva aikuisen virtsan taustasignaalista) ja useita positiivisia signaaleja 17 näytteessä. Näitä tuloksia tukivat ELISA-mittaukset. Kahdessa näytteessä oli kohonnut proteiini/kreatiniinitaso, mikä mahdollisesti viittaa munuaisvaurioon, mutta ne eivät tuottaneet CAI-positiivista virtsaa. Massaspektrianalyysi osoitti, että CAI-taso ei korreloi minkään muun punasoluproteiinin kanssa, mikä viittaa vahvasti siihen, että hemolyysi oli tapahtunut verisuonten sisällä eikä virtsateissä (jossa se johtaisi myös signaaleihin mm. hemoglobiini tai anioninvaihdin 1). CAI-negatiiviseen virtsaan verrattuna CAI-positiivisten näytteiden ylimääräinen proteiini oli itse asiassa CAI, mikä puoltaa tämän biomarkkerin erinomaista erottelukykyä. Kun otetaan huomioon virtsan keräysajankohta, on mahdollista selittää CAI-signaali suhteessa bilirubiinimittauksiin seuraavasti:

• Kuusi vauvaa, joiden bilirubiinitasot olivat alle kynnyksen (NHS-ohjeet valohoitoa varten), tuottivat CAI-negatiivista virtsaa;
• Kuudessatoista vauvassa, joiden bilirubiinitasot nousivat nopeasti ja merkittävästi (joista 14 sai valohoitoa), CAI-signaali oli voimakkain virtsanäytteissä, jotka kerättiin lähempänä bilirubiinihuippua, ja taipumus viittaa siihen, että CAI-piikki edelsi bilirubiinihuippua;
• Neljä vauvaa tuotti virtsaa erittäin vahvalla CAI-signaalilla, mutta ei osoittanut kohonnutta bilirubiinia, mikä väitti, että erillinen mekanismi tuottaa hemolyysin.

Hypoteesit: Ehdotamme, että virtsan CAI on hemolyysin biomarkkeri, ja oletamme, että:

1. Virtsan CAI-signaali voidaan kerrostaa suhteessa taustalla olevaan hemolyyttiseen tilaan:

   • havaitsematon: osoittaa, ettei hemolyysistä ole todisteita;
   • keskitaso: tasot, jotka viittaavat hemolyysiin keltaisilla vauvoilla;
   • korkeampi kynnys: osoittaa akuuttia hemolyyttistä kriisiä, joka ei välttämättä aiheuta bilirubiinin nousua.
2. Keskialueella positiivinen virtsan CAI-signaali edeltää bilirubiinin huippua ja on varhainen keltaisuuden indikaattori.

5 Kokeilun tavoitteet ja tarkoitus

Bilirubiinin ajan mittaa käytetään tällä hetkellä vastasyntyneiden terveyden mittaamiseen, mutta ehdotamme, että virtsan CAI-seuranta olisi varhainen varoitusmerkki riskipotilaiden tunnistamiseksi ja mahdollistaisi näin vastasyntyneiden osastojen rationalisoinnin paremmin. Tämän biomarkkerin hyödyllisyyden selvittämiseksi ehdotamme pitkittäistutkimuksen tekemistä täysiaikaisten vauvojen kohortilla virtsan CAI:n ja bilirubiinin välisen korreloimiseksi (hypoteesin 2 testaamiseksi) ja kliinisen tiedon saamiseksi, joka voi määrittää syyn. ja hemolyysin laajuus (hypoteesin 1 kynnystasojen ilmoittamiseksi).

Tutkimussuunnitelma: St Thomasissa syntyy 9 000 syntymää vuodessa. Näistä ~1000 vauvaa otetaan Neonatal Intensive Care Unit (NICU) -osastolle vuosittain; noin puolet näistä vauvoista syntyy aikanaan. Noin 300:lla on valohoitoa vaativaa keltaisuutta ja noin 10-20:lla vaikea hemolyysi (tyypillisesti ABO-yhteensopimattomuus). Tavoitteena on rekrytoida 30 täysiaikaista vauvaa enintään 24 kuukauden ajalle, joiden odotetaan pysyvän vastasyntyneiden osastolla vähintään viisi päivää ja enintään 10 päivää, jolloin virtsanäytteitä otetaan mahdollisimman säännöllisesti. (kerran päivässä; jos ei ole mahdollista, niin vähintään kerran kahdessa päivässä), aikaleimattu ja säilytetty erillisessä pakastimessa off-line-analyysiä varten Oxfordissa, kun rekrytointi on valmis. Kun se on mahdollista suorittaa lähellä keräyspistettä, pieni tilavuus virtsaa (enintään neljä pisaraa) pipetoidaan lateraalivirtauslaitteeseen (LFD), joka toimitetaan osana sarjaa CAI-immunoreaktiivisuuden välittömän lukeman saamiseksi. . LFD merkitään vastaavalla virtsan tunnisteella ja kirjataan (positiivinen/negatiivinen/tyhjä). Jos se ei ole mahdollista lähellä keräyspistettä, tämä vaihe suoritetaan myöhemmin Oxfordissa sulatetuille näytteille. Ei-invasiivinen transkutaaninen bilirubiinitaso mitataan ja kirjataan 6 tunnin kuluessa virtsanäytteestä. Näitä tietoja täydennetään seuraavilla tiedoilla, jotka on saatu osana normaalia kliinistä käytäntöä, joka ei liity tutkimuksen tavoitteisiin.

• Seerumin bilirubiini, josta kerätään rutiininomaisesti
• Veren hemoglobiini ja täysi verenkuva
• C-reaktiivinen proteiini (CRP) ja munuaisten toiminta
• Raskausaika;
• Valohoidon kesto ja ajoitus
• Syntymäpaino
• Seksiä
• Suoran Coombsin testin tulos;
• Syy tulla NICU:lle.

Virtsanäytteet analysoidaan Oxfordissa seuraavilla tavoilla:

• CAI-immunoreaktiivisuus Western blot -menetelmällä, erittäin herkkä puolikvantitatiivinen menetelmä;
• CAI-immunoreaktiivisuus ELISA:lla, kvantitatiivisella menetelmällä;
• Kokonaisproteiini ja kreatiniini munuaisvaurion merkkiaineina;
• Osmolaarisuus diureettisen tilan määrittämiseksi. Kaikki näytteet anonymisoidaan aakkosnumeerisella koodilla ja linkitetään kliinisiin tietoihin. Vauvat, joilta on otettu vähemmän kuin 4 virtsanäytettä, suljetaan pois tutkimuksesta sillä perusteella, että tällaisilla aineistoilla ei olisi ratkaisukykyä hypoteesien testaamiseen. Rekrytointi päättyy, kun 30 vauvaa vähintään 4 näytettä on rekrytoitu. Myös vauvat, joilla on kromosomipoikkeavuuksia, suljetaan pois tutkimuksesta.