Een longitudinale studie om de correlatie tussen CAI en bilirubine te analyseren

Bij pasgeborenen kan intravasculaire hemolyse variëren van mild, als onderdeel van de fysiologische vernieuwing van rode bloedcellen, tot ernstig in gevallen zoals geelzucht of ABO-incompatibiliteit. Vroege biomarkers van hemolyse zouden de neonatologische praktijk kunnen verbeteren door risicopatiënten te identificeren, vooral als de test eenvoudig, snel, niet-invasief en kwantitatief is. Ons nu afgeronde URICA-onderzoek met voldragen mannelijke baby's (onderzoeksregistratie CPMS 19576) toonde aan dat het kleine cytoplasmatische eiwit koolzuuranhydrase I (CAI), overvloedig aangetroffen in rode bloedcellen, werd gedetecteerd (door immunoassay en mass-spec), in 17 van de 26 urinemonsters die eenmaal per gerekruteerde baby op de afdeling neonatologie worden afgenomen. CAI-positieve monsters werden verkregen van baby's met niveaus van bilirubine die snel stijgen of pieken boven de drempel voor fototherapie. CAI-negatieve urine werd verkregen wanneer bilirubine de fototherapiedrempel niet bereikte, of nadat het hersteld was van zijn piek. Bij vier gelegenheden was de oorzaak van CAI-positieve urine onbepaald (https://doi.org/10.1093/jalm/jfaa051). Aangezien CAI normaal gesproken afwezig is in de urine, is een positief signaal indicatief voor intravasculaire hemolyse en bevestigt het dat CAI de glomerulaire barrière passeerde. Het kwantitatieve vermogen van urinaire CAI om een ​​dreigende hemolytische crisis te voorspellen en in te schatten, vereist echter een nieuwe longitudinale studie, wat het doel is van de URICA-II-studie.

Klinische grondgedachte: De gezondheid van pasgeborenen moet regelmatig worden gecontroleerd op een van de vele snel voortschrijdende en mogelijk levensbedreigende aandoeningen die intravasculaire hemolyse impliceren. Deze omvatten sepsis (bijv. grampositieve bacteriën), protozoaire infectie (bijv. malaria), allo-immuniteit (ABO- en Rhesus-incompatibiliteit), genetische kenmerken (bijv. sikkelcel, glucose-6-fosfaatdehydrogenase [G6PD]-deficiëntie) of elektrolytenonbalans. Sommige van deze voorwaarden (bijv. RhD, G6PD, sikkeltrek) komen vooral voor bij etnische minderheidsgroepen [1-4]. In geavanceerde zorginstellingen omvatten tests voor hemolyse het nemen van bloedmonsters voor microscopische analyses (bijv. celtelling en morfologie) of biochemische assays (bijv. voor ongeconjugeerd bilirubine of lactaatdehydrogenase). Er zijn andere middelenintensieve tests beschikbaar om specifieke oorzaken van hemolyse te diagnosticeren, zoals auto-immuun hemolytische anemie met Coombs-test of G6PD-deficiëntie door redoxassays. Deze tests vereisen opgeleid personeel, geavanceerde laboratoriumapparatuur en hoge hygiënenormen. Eenvoudiger, goedkoper en sneller testen op nieuwe biomarkers van ziekte, aangepast voor point-of-care, minimale laboratoriumomstandigheden, zouden medisch en economisch verantwoord zijn. Deze technologie zou ook ten goede komen aan ontwikkelingslanden, waar hemolyse vaker voorkomt.

Wetenschappelijke achtergrond: Het oplosbare enzym koolzuuranhydrase I (CAI) is, na hemoglobine-isovormen, het meest voorkomende eiwit in het cytoplasma van rode bloedcellen [5]. Plasma bevat normaal gesproken slechts sporen van CAI, maar de niveaus zullen toenemen bij hemolyse [6]. Op basis van zijn kleine omvang (29 kDa en Stokes-radius 25 Å [7-9] wordt voorspeld dat CAI door de glomerulaire barrière filtert en in de urine verschijnt [10]. Kwantitatieve immunotechnieken kunnen CAI detecteren, zelfs bij een verdunning van 1:10.000. Urine van gezonde volwassenen bevat normaal gesproken geen CAI, waardoor een zeer laag achtergrondsignaal wordt geproduceerd. De excretie van CAI in de urine is naar verwachting evenredig met de mate van hemolyse en dient daarom als een kwantitatieve biomarker die niet-invasief kan worden getest.

Doelstellingen van de (eerste) URICA-studie: De doelstelling van de nu voltooide URICA-studie (URinaire excretie van koolzuuranhydrase; registratie van de studie CPMS 19576) was het testen op de aanwezigheid van CA-isovormen in de urine van voldragen pasgeborenen die werden opgenomen in Evelina's Children. Ziekenhuis. Het cohort omvatte controles waarvan niet werd vermoed dat ze hemolyse ondergingen (buiten de milde fysiologische vorm), evenals baby's met ABO-incompatibiliteit, bloedarmoede en die een behandeling voor geelzucht ondergingen. De URICA-studie kreeg ethische goedkeuring op 12 mei 2015 (REC: 15/NS/0042). De verzameling en analyse van monsters was in juni 2017 voltooid. Metingen op urine bestaande uit Western-blotting voor CAI (een gevoelige maar semi-kwantitatieve methode), ELISA voor CAI (een kwantitatieve methode voor het bepalen van CAI-niveaus), massaspecificaties voor het verkrijgen van het proteoom van urine, plus metingen van totaal eiwit en creatinine ( om bewijs voor nierfalen als uitsluitingscriterium te beoordelen). Daarnaast werden klinische gegevens verzameld over de zwangerschap en bloedhemoglobine, serum of transcutaan bilirubine en C-reactief proteïne op verschillende tijdstippen, waar mogelijk, om te testen op respectievelijk bloedarmoede, geelzucht en infectie. Er werden 26 baby's gerekruteerd.

Resultaten van de URICA-studie: Western-blotting toonde geen detecteerbaar CAI-signaal in 9 monsters (niet te onderscheiden van achtergrondsignaal in volwassen urine) en een reeks positieve signalen in 17 monsters. Deze resultaten werden ondersteund door ELISA-metingen. Twee monsters hadden verhoogde eiwit-/creatininespiegels, mogelijk wijzend op nierbeschadiging, maar deze produceerden geen CAI-positieve urine. Mass Spec-analyse toonde aan dat het CAI-niveau niet correleerde met enig ander eiwit van de rode bloedcellen, wat er sterk op wijst dat de hemolyse had plaatsgevonden in de vaten en niet in de urinewegen (waar het ook zou leiden tot signalen van b.v. hemoglobine of anionenwisselaar 1). In vergelijking met CAI-negatieve urine was het meest overvloedige eiwit in CAI-positieve monsters in feite CAI, wat pleitte voor het uitstekende oplossend vermogen van deze biomarker. Als we kijken naar het tijdstip waarop urine werd verzameld, is het mogelijk om het CAI-signaal ten opzichte van bilirubinemetingen als volgt te verklaren:

• Zes baby's met subdrempelige bilirubinespiegels (NHS-richtlijnen voor fototherapie) produceerden CAI-negatieve urine;
• Bij zestien baby's met snel en significant stijgende bilirubinespiegels (waarvan er 14 fototherapie kregen), was het CAI-signaal het sterkst in urinemonsters die dichter bij de bilirubinepiek werden verzameld, met een neiging om te suggereren dat de CAI-piek voorafging aan de bilirubinepiek;
• Vier baby's produceerden urine met een zeer sterk CAI-signaal, maar vertoonden geen verhoogd bilirubine, met het argument dat een ander mechanisme hemolyse veroorzaakt.

Hypotheses: We stellen voor dat CAI in de urine een biomarker is voor hemolyse, en we veronderstellen dat:

1. Urine-CAI-signaal kan worden gestratificeerd om verband te houden met de onderliggende hemolytische toestand:

   • ondetecteerbaar: geeft aan dat er geen bewijs is voor hemolyse;
   • intermediair: niveaus die duiden op hemolyse bij geelzuchtige baby's;
   • hogere drempel: duidt op een acute hemolytische crisis die mogelijk geen aanleiding geeft tot een verhoging van bilirubine.
2. In het middellange bereik gaat een positief urinair CAI-signaal vooraf aan de piek van bilirubine en is dit een vroege indicator van geelzucht.

5 Proefdoelstellingen en doel

Het tijdsverloop van bilirubine wordt momenteel gebruikt om de neonatale gezondheid te meten, maar we stellen voor dat urinaire CAI-monitoring een vroegtijdig waarschuwingssignaal zou zijn voor het identificeren van risicopatiënten, waardoor neonatale afdelingen hun middelen beter kunnen rationaliseren. Om het nut van deze biomarker vast te stellen, stellen we voor om een ​​longitudinaal onderzoek uit te voeren op een cohort voldragen baby's om het tijdsverloop van urine-CAI te correleren met bilirubine (om hypothese 2 te testen), en om klinische informatie te verkrijgen die de oorzaak kan bepalen. en mate van hemolyse (om drempelniveaus voor hypothese 1 te informeren).

Onderzoeksplan: Er zijn 9.000 geboorten per jaar in St. Thomas'. Hiervan worden jaarlijks ~ 1000 baby's opgenomen op de Neonatale Intensive Care Unit (NICU); ongeveer de helft van deze baby's wordt voldragen geboren. Ongeveer 300 hebben geelzucht die fototherapie nodig hebben en ongeveer 10-20 hebben ernstige hemolyse (meestal ABO-incompatibiliteit). Het doel is om 30 voldragen baby's te werven, over een periode van maximaal 24 maanden, die naar verwachting minimaal vijf dagen en maximaal tien dagen op de neonatale afdeling zullen blijven, waarbij zo regelmatig mogelijk urine wordt afgenomen. (een keer per dag; indien niet mogelijk, dan minstens een keer per twee dagen), voorzien van een tijdstempel en opgeslagen in een speciale vriezer voor offline analyse in Oxford, zodra de werving is voltooid. Indien mogelijk dichtbij het verzamelpunt, wordt een klein volume urine (niet meer dan vier druppeltjes) gepipetteerd op een lateral flow device (LFD), geleverd als onderdeel van een kit, om een ​​onmiddellijke uitlezing van de CAI-immunoreactiviteit te verkrijgen . De LFD wordt gelabeld met de overeenkomende urine-identificatie en geregistreerd (positief/negatief/ongeldig). Als dit niet haalbaar is in de buurt van het verzamelpunt, wordt deze stap later uitgevoerd, in Oxford, op ontdooide monsters. Binnen 6 uur na het urinemonster wordt een niet-invasieve transcutane bilirubinespiegel verkregen en geregistreerd. Deze gegevens zullen worden aangevuld met de volgende informatie, verkregen als onderdeel van de normale klinische praktijk die geen verband houdt met de doelstellingen van het onderzoek.

• Serumbilirubine werd routinematig verzameld
• Bloedhemoglobine en volledig bloedbeeld
• C-reactief proteïne (CRP) en nierfunctie
• zwangerschapsduur;
• Duur en timing van fototherapie
• Geboortegewicht
• Seks
• Resultaat van directe Coombs-test;
• Reden van opname op de NICU.

Urinemonsters worden in Oxford geanalyseerd op:

• CAI-immunoreactiviteit op western blot, een zeer gevoelige semi-kwantitatieve methode;
• CAI-immunoreactiviteit door ELISA, een kwantitatieve methode;
• Totaal eiwit en creatinine als markers van nierbeschadiging;
• Osmolariteit, om de diuretische toestand te bepalen. Alle stalen worden geanonimiseerd met een alfanumerieke code en gekoppeld aan klinische gegevens. Baby's van wie minder dan 4 urinemonsters worden verkregen, worden uitgesloten van het onderzoek omdat dergelijke datasets niet het oplossend vermogen zouden hebben om de hypothesen te testen. De werving is voltooid wanneer 30 baby's met ten minste 4 monsters zijn gerekruteerd. Ook baby's met chromosomale afwijkingen worden van het onderzoek uitgesloten.