CAI와 빌리루빈의 상관관계 분석을 위한 종단적 연구

신생아에서 혈관내 용혈은 적혈구의 생리적 전환의 일부인 경증에서 황달 또는 ABO 부적합과 같은 경우 중증까지 다양할 수 있습니다. 용혈의 조기 바이오마커는 특히 분석이 간단하고 빠르며 비침습적이며 정량적인 경우 위험에 처한 환자를 식별하여 신생아 진료를 개선할 것입니다. 만삭 남아에 대한 우리의 현재 완료된 URICA 시험(시험 등록 CPMS 19576)은 적혈구에서 풍부하게 발견되는 작은 세포질 단백질 탄산 탈수 효소 I(CAI)가 신생아 병동에서 모집된 아기당 한 번씩 수집된 26개 소변 샘플 중 17개. CAI 양성 샘플은 빌리루빈 수치가 급격히 상승하거나 광선 요법의 임계값을 초과하는 아기에게서 얻었습니다. CAI 음성 소변은 빌리루빈이 광선 요법 역치에 도달하지 않았거나 최고점에서 회복된 후에 채취되었습니다. 네 차례에 걸쳐 CAI 양성 소변의 원인이 확인되지 않았습니다(https://doi.org/10.1093/jalm/jfaa051). CAI는 일반적으로 소변에 없기 때문에 양성 신호는 혈관내 용혈을 나타내며 CAI가 사구체 장벽을 통과했음을 확인합니다. 그러나 임박한 용혈성 위기를 예측하고 추정하는 요로 CAI의 정량적 힘은 URICA-II 시험의 목적인 새로운 종적 연구가 필요합니다.

임상적 근거: 신생아의 건강은 빠르게 진행되고 잠재적으로 생명을 위협할 수 있는 혈관내 용혈과 관련된 상태 중 하나에 대해 정기적으로 모니터링해야 합니다. 여기에는 패혈증(예: 그람 양성 박테리아), 원충 감염(예: 말라리아), 동종면역(ABO 및 Rhesus 비호환성), 유전적 특성(예: 낫적혈구, 포도당-6-인산탈수소효소[G6PD] 결핍) 또는 전해질 불균형. 이러한 조건 중 일부(예: RhD, G6PD, 낫 형질)은 특히 소수 민족 집단에서 만연합니다[1-4]. 고급 의료 시설에서 용혈 검사에는 현미경 분석을 위한 혈액 샘플 채취가 포함됩니다(예: 세포 수 및 형태) 또는 생화학적 분석(예: 비접합 빌리루빈 또는 젖산 탈수소효소). Coombs 테스트를 통한 자가면역 용혈성 빈혈 또는 산화환원 분석을 통한 G6PD 결핍과 같은 용혈의 특정 원인을 진단하기 위해 리소스를 많이 사용하는 다른 테스트를 사용할 수 있습니다. 이러한 테스트에는 숙련된 직원, 고급 실험실 장비 및 높은 위생 기준이 필요합니다. 현장 진료, 최소 실험실 조건에 맞게 조정된 질병의 새로운 바이오마커에 대한 더 간단하고 저렴하며 빠른 테스트는 의학적으로나 경제적으로 정당화될 것입니다. 이 기술은 용혈이 더 흔한 개발도상국에도 도움이 될 것입니다.

과학적 배경: 용해성 효소 탄산탈수효소 I(CAI)는 적혈구의 세포질에서 헤모글로빈 이소형 다음으로 가장 풍부한 단백질입니다[5]. 혈장에는 일반적으로 미량의 CAI만 포함되어 있지만 용혈 시 수치가 증가합니다[6]. 작은 크기(29 kDa 및 스톡스 반경 25 Å[7-9])를 기반으로 CAI는 사구체 장벽을 가로질러 여과되어 소변에 나타날 것으로 예측됩니다[10]. 정량적 면역 기술은 1:10,000 희석에서도 CAI를 감지할 수 있습니다. 건강한 성인의 소변에는 일반적으로 CAI가 없으며 매우 낮은 배경 신호를 생성합니다. 소변 CAI 배설은 용혈 정도에 비례할 것으로 예상되므로 비침습적으로 분석할 수 있는 정량적 바이오마커 역할을 합니다.

(첫 번째) URICA 시험의 목적: 현재 완료된 URICA 시험(탄산 탈수 효소의 URInary 배설, 시험 등록 CPMS 19576)의 목적은 Evelina's Children에 입원한 만삭 신생아의 소변에서 CA 이소형의 존재를 테스트하는 것이었습니다. 병원. 코호트에는 ABO 부적합, 빈혈 및 황달 치료를 받고 있는 아기뿐만 아니라 용혈(경미한 생리학적 형태 이상)을 겪고 있는 것으로 의심되지 않는 대조군이 포함되었습니다. URICA 시험은 2015년 5월 12일에 윤리적 승인을 받았습니다(REC: 15/NS/0042). 샘플 수집 및 분석은 2017년 6월까지 완료되었습니다. 소변 측정은 CAI(민감하지만 반정량적 방법)에 대한 웨스턴 블롯팅, CAI(CAI 수준을 결정하기 위한 정량적 방법)에 대한 ELISA, 소변의 프로테옴을 얻기 위한 질량 분석, 총 단백질 및 크레아티닌 측정으로 구성됩니다. 신부전의 증거를 배제 기준으로 평가하기 위해). 또한 빈혈, 황달, 감염 여부를 각각 검사하기 위해 가능한 여러 시점에서 임신, 혈중 헤모글로빈, 혈청 또는 경피적 빌리루빈 및 C 반응성 단백질에 대한 임상 데이터를 수집했습니다. 26명의 아기가 모집되었습니다.

URICA 시험의 결과: 웨스턴 블롯팅은 9개 샘플에서 검출 가능한 CAI 신호를 나타내지 않았고(성인 소변의 배경 신호와 구분할 수 없음) 17개 샘플에서 다양한 양성 신호를 보여주었습니다. 이러한 결과는 ELISA 측정에 의해 뒷받침되었습니다. 2개의 샘플은 단백질/크레아티닌 수치가 높아 신장 손상을 나타낼 수 있지만 CAI 양성 소변을 생성하지 않았습니다. 질량 분석 결과 CAI 수치는 다른 적혈구 단백질과 상관관계가 없는 것으로 나타났습니다. 이는 용혈이 요로가 아닌 혈관 내부에서 발생했음을 강력하게 나타냅니다. 헤모글로빈 또는 음이온 교환기 1). CAI 음성 소변과 비교할 때 CAI 양성 샘플에서 가장 과잉 단백질은 사실 CAI였으며 이 바이오마커의 탁월한 분해능을 주장합니다. 소변을 채취한 시점을 고려할 때 빌리루빈 측정과 관련된 CAI 신호를 다음과 같이 설명할 수 있습니다.

• 역치 이하의 빌리루빈 수치(광선 요법에 대한 NHS 지침)를 가진 6명의 아기는 CAI 음성 소변을 생성했습니다.
• 빌리루빈 수치가 급격하고 유의하게 상승한 16명의 아기(그 중 14명은 광선 요법을 받음)에서 CAI 신호는 빌리루빈 최고점에 더 가깝게 수집된 소변 샘플에서 가장 강했으며 CAI 스파이크가 빌리루빈 최고점에 선행하는 것으로 시사하는 경향이 있었습니다.
• 4명의 아기는 매우 강한 CAI 신호로 소변을 보았지만 빌리루빈 상승을 나타내지 않았으며 뚜렷한 메커니즘이 용혈을 유발한다고 주장했습니다.

가설: 우리는 소변 CAI가 용혈의 바이오마커라고 제안하고 다음과 같은 가설을 세웁니다.

1. 소변 CAI 신호는 기본 용혈 상태와 관련하여 계층화할 수 있습니다.

   • 감지할 수 없음: 용혈에 대한 증거가 없음을 나타냄;
   • 중간: 황달이 있는 아기의 용혈을 나타내는 수준;
   • 더 높은 역치: 빌리루빈의 상승을 유발하지 않을 수 있는 급성 용혈성 위기를 나타냅니다.
2. 중간 범위에서 양성 요 CAI 신호는 빌리루빈 최고점에 선행하며 황달의 초기 지표입니다.

5 시험 목적 및 목적

빌리루빈의 시간 경과는 현재 신생아 건강을 측정하는 데 사용되지만 요로 CAI 모니터링은 위험에 처한 환자를 식별하기 위한 조기 경고 신호를 제공하여 신생아 병동이 자원을 더 잘 합리화할 수 있도록 합니다. 이 바이오마커의 유용성을 확립하기 위해, 우리는 요로 CAI의 시간 경과를 빌리루빈과 연관시키기 위해 만삭아 코호트에 대한 종단 연구를 수행하고(가설 2를 테스트하기 위해) 원인을 결정할 수 있는 임상 정보를 얻을 것을 제안합니다. 및 용혈 정도(가설 1에 대한 역치 수준을 알리기 위해).

연구 계획: St Thomas'에서 매년 9,000명의 출생이 있습니다. 이 중 ~1000명의 아기가 매년 신생아 집중 치료실(NICU)에 입원합니다. 이 아기의 약 절반은 만삭에 태어납니다. 약 300명은 황달에 광선 요법이 필요하고 10-20명은 심한 용혈(일반적으로 ABO 부적합)을 겪을 것입니다. 목표는 24개월 이하의 기간 동안 최소 5일에서 최대 10일 동안 신생아실에 남아 가능한 한 정기적으로 소변 샘플을 채취할 것으로 예상되는 30명의 만삭아를 모집하는 것입니다. (하루에 한 번; 가능하지 않은 경우 적어도 이틀에 한 번), 채용이 완료되면 옥스포드에서 오프라인 분석을 위해 타임 스탬프를 찍고 전용 냉동고에 보관합니다. 수집 지점 가까이에서 수행할 수 있는 경우 소량의 소변(4방울 이하)을 키트의 일부로 제공되는 측면 흐름 장치(LFD)에 피펫팅하여 CAI 면역 반응성을 즉시 판독합니다. . LFD는 일치하는 소변 식별자로 라벨링되고 기록됩니다(양성/음성/무효). 수집 지점 근처에서 가능하지 않은 경우 이 단계는 나중에 Oxford에서 해동된 샘플에 대해 수행됩니다. 소변 샘플 6시간 이내에 비침습적 경피적 빌리루빈 수치를 얻고 기록합니다. 이 데이터는 임상시험 목적과 무관한 정상적인 임상 실습의 일부로 얻은 다음 정보로 보완됩니다.

• 일상적으로 수집되는 혈청 빌리루빈
• 혈액 헤모글로빈 및 전체 혈구 수
• C-반응성 단백질(CRP) 및 신장 기능
• 임신 적령기;
• 광선 요법의 기간 및 시기
• 출생 체중
• 섹스
• 직접 Coombs 테스트 결과;
• NICU에 입학한 이유.

소변 샘플은 옥스퍼드에서 다음과 같이 분석됩니다.

• 고도로 민감한 반정량적 방법인 웨스턴 블롯에 대한 CAI 면역반응성;
• 정량적 방법인 ELISA에 의한 CAI 면역반응성;
• 신장 손상의 지표인 총 단백질 및 크레아티닌;
• 이뇨 상태를 결정하기 위한 삼투압. 모든 샘플은 영숫자 코드로 익명화되고 임상 데이터에 연결됩니다. 4개 미만의 소변 샘플을 얻은 아기는 그러한 데이터 세트가 가설을 테스트할 분해능이 없기 때문에 연구에서 제외됩니다. 최소 4개의 샘플로 30명의 아기가 모집되면 모집이 완료됩니다. 염색체 이상이 있는 아기도 연구에서 제외됩니다.