Badanie podłużne w celu analizy korelacji między CAI a bilirubiną

U noworodków hemoliza wewnątrznaczyniowa może wahać się od łagodnej, będącej częścią fizjologicznego obrotu krwinek czerwonych, do ciężkiej w przypadkach takich jak żółtaczka lub niezgodność ABO. Wczesne biomarkery hemolizy poprawiłyby praktykę neonatologiczną poprzez identyfikację pacjentów z grupy ryzyka, zwłaszcza jeśli test jest prosty, szybki, nieinwazyjny i ilościowy. Nasze zakończone obecnie badanie URICA na dzieciach płci męskiej urodzonych w terminie (rejestracja próbna CPMS 19576) wykazało, że mała anhydraza węglanowa I (CAI) białka cytoplazmatycznego, występująca obficie w krwinkach czerwonych, została wykryta (za pomocą testu immunologicznego i masowego) w 17 z 26 próbek moczu pobrano raz na dziecko rekrutowane na oddziale neonatologii. Próbki CAI-dodatnie uzyskano od niemowląt z poziomem bilirubiny, który szybko wzrasta lub osiąga wartość szczytową powyżej progu fototerapii. CaI-ujemny mocz uzyskano, gdy stężenie bilirubiny nie osiągnęło progu fototerapii lub po powrocie do wartości szczytowej. W czterech przypadkach przyczyna moczu z wynikiem CAI była nieokreślona (https://doi.org/10.1093/jalm/jfaa051). Ponieważ CAI normalnie nie występuje w moczu, dodatni sygnał wskazuje na hemolizę wewnątrznaczyniową i potwierdza, że ​​CAI przekroczył barierę kłębuszkową. Jednak ilościowa moc CAI w moczu do przewidywania i szacowania zbliżającego się kryzysu hemolitycznego wymaga nowego badania podłużnego, które jest celem badania URICA-II.

Uzasadnienie kliniczne: Stan zdrowia noworodków należy regularnie monitorować pod kątem jednego z wielu szybko postępujących i potencjalnie zagrażających życiu stanów, które wiążą się z hemolizą wewnątrznaczyniową. Należą do nich sepsa (np. bakterie Gram-dodatnie), zakażenia pierwotniakami (np. malaria), alloimmunizacja (niekompatybilność ABO i Rhesus), cechy genetyczne (np. niedokrwistość sierpowatokrwinkowa, niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej [G6PD]) lub zaburzenia równowagi elektrolitowej. Niektóre z tych warunków (np. RhD, G6PD, cecha sierpowata) są szczególnie rozpowszechnione w mniejszościowych grupach etnicznych [1-4]. W nowoczesnych placówkach służby zdrowia testy na hemolizę polegają na pobraniu próbek krwi do analiz mikroskopowych (np. liczbę i morfologię komórek) lub testy biochemiczne (np. oznaczanie nieskoniugowanej bilirubiny lub dehydrogenazy mleczanowej). Dostępne są inne testy wymagające dużych zasobów do diagnozowania określonych przyczyn hemolizy, takich jak autoimmunologiczna niedokrwistość hemolityczna za pomocą testu Coombsa lub niedobór G6PD za pomocą testów redoks. Testy te wymagają przeszkolonego personelu, zaawansowanego sprzętu laboratoryjnego i wysokich standardów higieny. Prostsze, tańsze i szybsze testy nowych biomarkerów chorób, przystosowane do warunków minimalnych w miejscu opieki, byłyby uzasadnione medycznie i ekonomicznie. Ta technologia byłaby również korzystna dla krajów rozwijających się, gdzie hemoliza może być bardziej powszechna.

Podstawa naukowa: Rozpuszczalny enzym anhydraza węglanowa I (CAI) jest po izoformach hemoglobiny najobficiej występującym białkiem w cytoplazmie krwinek czerwonych [5]. Osocze zwykle zawiera tylko śladowe ilości CAI, ale ich poziom wzrasta podczas hemolizy [6]. W oparciu o jego mały rozmiar (29 kDa i promień Stokesa 25 Å [7-9] przewiduje się, że CAI przenika przez barierę kłębuszkową i pojawia się w moczu [10]. Ilościowe techniki immunologiczne mogą wykryć CAI nawet w rozcieńczeniu 1:10 000. Mocz zdrowych osób dorosłych jest zwykle pozbawiony CAI, co daje bardzo niski sygnał tła. Oczekuje się, że wydalanie CAI z moczem będzie proporcjonalne do stopnia hemolizy, a zatem służy jako ilościowy biomarker, który można oznaczać nieinwazyjnie.

Cele (pierwszego) badania URICA: Celem zakończonego już badania URICA (wydalanie anhydrazy węglanowej z moczem; rejestracja badania CPMS 19576) było zbadanie obecności izoform CA w moczu noworodków przyjętych w terminie na Oddział Dzieci Eveliny Szpital. Kohorta obejmowała grupy kontrolne, u których nie podejrzewano przechodzenia hemolizy (poza łagodną postacią fizjologiczną), a także dzieci z niezgodnością układu ABO, anemią i przechodzące leczenie żółtaczki. Badanie URICA uzyskało etyczną zgodę 12 maja 2015 r. (REC: 15/NS/0042). Pobieranie i analizę próbek zakończono do czerwca 2017 r. Pomiary moczu obejmowały test Western blot w kierunku CAI (czuła, ale półilościowa metoda), test ELISA w kierunku CAI (metoda ilościowa oznaczania poziomów CAI), spektroskopię masową w celu uzyskania proteomu moczu oraz pomiary białka całkowitego i kreatyniny ( do oceny dowodów na niewydolność nerek jako kryterium wykluczenia). Ponadto zebrano dane kliniczne dotyczące ciąży oraz stężenia hemoglobiny we krwi, bilirubiny w surowicy lub przezskórnej oraz białka C-reaktywnego w kilku punktach czasowych, o ile to możliwe, w celu zbadania, odpowiednio, anemii, żółtaczki i zakażenia. Zrekrutowano 26 dzieci.

Wyniki badania URICA: Analiza Western blot nie wykazała wykrywalnego sygnału CAI w 9 próbkach (nie do odróżnienia od sygnału tła w moczu dorosłych) oraz szereg pozytywnych sygnałów w 17 próbkach. Wyniki te zostały poparte pomiarami ELISA. Dwie próbki miały podwyższony poziom białka/kreatyniny, prawdopodobnie wskazujący na uszkodzenie nerek, ale nie dały one CAI-dodatniego moczu. Analiza spektroskopii masowej wykazała, że ​​poziom CAI nie korelował z żadnym innym białkiem krwinek czerwonych, co zdecydowanie wskazuje, że hemoliza zachodziła wewnątrz naczyń, a nie w drogach moczowych (gdzie prowadziłaby również do sygnałów z np. hemoglobina lub wymieniacz anionowy 1). W porównaniu z moczem CAI-ujemnym, najbardziej obfitym białkiem w próbkach CAI-dodatnich był w rzeczywistości CAI, co przemawia za doskonałą zdolnością rozdzielczą tego biomarkera. Biorąc pod uwagę punkt czasowy, w którym pobrano mocz, możliwe jest wyjaśnienie sygnału CAI w odniesieniu do pomiarów bilirubiny w następujący sposób:

• Sześcioro dzieci z podprogowymi poziomami bilirubiny (wytyczne NHS dotyczące fototerapii) wytworzyło mocz z ujemnym wynikiem CAI;
• U szesnaściorga dzieci z szybko i znacząco rosnącym poziomem bilirubiny (z których 14 otrzymało fototerapię), sygnał CAI był najsilniejszy w próbkach moczu pobranych bliżej szczytu bilirubiny, z tendencją do sugerowania, że ​​szczyt CAI poprzedzał szczyt bilirubiny;
• Czworo dzieci oddało mocz z bardzo silnym sygnałem CAI, ale nie wykazywało podwyższonej bilirubiny, argumentując, że hemolizę wywołuje odrębny mechanizm.

Hipotezy: Proponujemy, że CAI w moczu jest biomarkerem hemolizy i stawiamy hipotezę, że:

1. Sygnał CAI w moczu można podzielić na warstwy, aby odnosić się do podstawowego stanu hemolitycznego:

   • niewykrywalny: wskazujący na brak dowodów na hemolizę;
   • pośrednie: poziomy wskazujące na hemolizę u dzieci z żółtaczką;
   • wyższy próg: wskazujący na ostry kryzys hemolityczny, który może nie powodować wzrostu stężenia bilirubiny.
2. W zakresie pośrednim dodatni sygnał CAI w moczu poprzedza szczytowe stężenie bilirubiny i jest wczesnym wskaźnikiem żółtaczki.

5 Cele i cel próby

Przebieg czasowy bilirubiny jest obecnie używany do oceny stanu zdrowia noworodków, ale proponujemy, aby monitorowanie CAI moczu stanowiło wczesny znak ostrzegawczy w celu identyfikacji pacjentów z grupy ryzyka, a tym samym umożliwiłoby oddziałom noworodkowym lepszą racjonalizację zasobów. Aby ustalić przydatność tego biomarkera, proponujemy przeprowadzenie badania podłużnego na kohorcie noworodków urodzonych o czasie w celu skorelowania przebiegu czasowego CAI w moczu z bilirubiną (w celu sprawdzenia hipotezy 2) oraz uzyskania informacji klinicznych, które mogą określić przyczynę i zakres hemolizy (w celu określenia poziomów progowych dla hipotezy 1).

Plan badawczy: W szpitalu św. Tomasza odbywa się 9 000 urodzeń rocznie. Spośród nich około 1000 dzieci jest przyjmowanych każdego roku na oddział intensywnej terapii noworodków (NICU); około połowa z tych dzieci rodzi się o czasie. Około 300 będzie miało żółtaczkę wymagającą fototerapii, a ~10-20 będzie miało ciężką hemolizę (zwykle niezgodność ABO). Celem jest rekrutacja 30 noworodków urodzonych o czasie, w okresie nie dłuższym niż 24 miesiące, które mają pozostać na oddziale noworodkowym przez co najmniej pięć dni i maksymalnie 10 dni, podczas których próbki moczu będą pobierane tak regularnie, jak to możliwe (raz dziennie; jeśli nie jest to możliwe, to co najmniej raz na dwa dni), opatrzone znacznikiem czasu i przechowywane w dedykowanej zamrażarce do analizy off-line w Oksfordzie, po zakończeniu rekrutacji. Jeśli jest to możliwe do wykonania w pobliżu miejsca pobrania, niewielka objętość moczu (nie więcej niż cztery krople) zostanie odpipetowana do urządzenia z przepływem bocznym (LFD), dostarczonego jako część zestawu, w celu uzyskania natychmiastowego odczytu immunoreaktywności CAI . LFD należy oznaczyć pasującym identyfikatorem moczu i zapisać (pozytywny/negatywny/pusty). Jeśli nie jest to wykonalne w pobliżu miejsca pobrania, krok ten zostanie przeprowadzony później, w Oksfordzie, na rozmrożonych próbkach. W ciągu 6 godzin od pobrania próbki moczu uzyskany i zarejestrowany zostanie nieinwazyjny przezskórny poziom bilirubiny. Dane te zostaną uzupełnione o następujące informacje uzyskane w ramach normalnej praktyki klinicznej niezwiązanej z celami badania.

• Rutynowo pobierano bilirubinę w surowicy
• Hemoglobina i pełna morfologia krwi
• Białko C-reaktywne (CRP) a czynność nerek
• Wiek ciążowy;
• Czas trwania i czas fototerapii
• Waga urodzeniowa
• Seks
• Wynik bezpośredniego testu Coombsa;
• Powód przyjęcia na NICU.

Próbki moczu będą analizowane w Oksfordzie pod kątem:

• Immunoreaktywność CAI metodą Western blot, wysoce czułą metodą półilościową;
• Immunoreaktywność CAI metodą ELISA, metoda ilościowa;
• Białko całkowite i kreatynina jako markery uszkodzenia nerek;
• Osmolarność, w celu określenia stanu moczopędnego. Wszystkie próbki zostaną zanonimizowane za pomocą kodu alfanumerycznego i powiązane z danymi klinicznymi. Niemowlęta, od których uzyskano mniej niż 4 próbki moczu, zostaną wykluczone z badania na podstawie tego, że takie zestawy danych nie miałyby mocy rozdzielczej do testowania hipotez. Rekrutacja zakończy się, gdy zwerbowanych zostanie 30 dzieci z co najmniej 4 próbkami. Niemowlęta z nieprawidłowościami chromosomalnymi również zostaną wykluczone z badania.