En longitudinel undersøgelse til at analysere sammenhængen mellem CAI og bilirubin

Hos nyfødte kan intravaskulær hæmolyse variere fra mild, som en del af den fysiologiske omsætning af røde blodlegemer, til alvorlig i tilfælde som gulsot eller ABO-inkompatibilitet. Tidlige biomarkører for hæmolyse ville forbedre neonatologisk praksis ved at identificere risikopatienter, især hvis analysen er enkel, hurtig, ikke-invasiv og kvantitativ. Vores nu afsluttede URICA-forsøg på fuldbårne hanbørn (forsøgsregistrering CPMS 19576) viste, at det lille cytoplasmatiske protein carbonic anhydrase I (CAI), der findes rigeligt i røde blodlegemer, blev påvist (ved immunoassay og masse-spec), i 17 ud af 26 urinprøver indsamlet én gang pr. rekrutteret baby på neonatologisk afdeling. CAI-positive prøver blev opnået fra babyer med niveauer af bilirubin, der hurtigt stiger eller topper over tærsklen for fototerapi. CAI-negativ urin blev opnået, når enten bilirubin ikke nåede tærskelværdien for fototerapi, eller efter at det var kommet sig efter sit højeste. Ved fire lejligheder var årsagen til CAI-positiv urin ikke fastlagt (https://doi.org/10.1093/jalm/jfaa051). Da CAI normalt er fraværende i urinen, er et positivt signal tegn på intravaskulær hæmolyse og bekræfter, at CAI krydsede den glomerulære barriere. Den kvantitative kraft af urin-CAI til at forudsige og estimere en forestående hæmolytisk krise kræver imidlertid en ny longitudinel undersøgelse, som er formålet med URICA-II-forsøget.

Klinisk begrundelse: Nyfødtes helbred skal overvåges regelmæssigt for en af ​​mange hurtigt udviklende og potentielt livstruende tilstande, der implicerer intravaskulær hæmolyse. Disse omfatter sepsis (f.eks. Gram-positive bakterier), protozoinfektion (f.eks. malaria), alloimmunitet (ABO og Rhesus inkompatibilitet), genetiske egenskaber (f.eks. seglcelle, glucose-6-phosphat dehydrogenase [G6PD] mangel) eller elektrolyt ubalance. Nogle af disse tilstande (f.eks. RhD, G6PD, segltræk) er særligt udbredt i etniske minoritetsgrupper [1-4]. I avancerede sundhedsfaciliteter involverer test for hæmolyse at tage blodprøver til mikroskopianalyser (f. celletal og morfologi) eller biokemiske assays (f.eks. for ukonjugeret bilirubin eller lactatdehydrogenase). Andre ressourcekrævende tests er tilgængelige for at diagnosticere specifikke årsager til hæmolyse, såsom autoimmun hæmolytisk anæmi med Coombs-test eller G6PD-mangel ved redoxassays. Disse tests kræver uddannet personale, avanceret laboratorieudstyr og høje standarder for hygiejne. Enklere, billigere og hurtigere tests på nye biomarkører for sygdom, tilpasset til plejepunkter, minimale laboratorieforhold, ville være medicinsk og økonomisk berettiget. Denne teknologi ville også gavne udviklingslandene, hvor hæmolyse kan være mere almindelig.

Videnskabelig baggrund: Det opløselige enzym kulsyreanhydrase I (CAI) er efter hæmoglobinisoformer det mest udbredte protein i de røde blodlegemers cytoplasma [5]. Plasma indeholder normalt kun spormængder af CAI, men niveauerne vil stige ved hæmolyse [6]. Baseret på dens lille størrelse (29 kDa og Stokes radius 25 Å [7-9] forventes CAI at filtrere hen over den glomerulære barriere og vises i urinen [10]. Kvantitative immunteknikker kan detektere CAI selv ved 1:10.000 fortynding. Urin fra raske voksne er normalt blottet for CAI, hvilket producerer et meget lavt baggrundssignal. Urin CAI-udskillelse forventes at være proportional med omfanget af hæmolyse og fungerer derfor som en kvantitativ biomarkør, der kan analyseres non-invasivt.

Formål med det (første) URICA-forsøg: Formålet med det nu afsluttede URICA-forsøg (urinær udskillelse af kulsyreanhydrase; forsøgsregistrering CPMS 19576) var at teste for tilstedeværelsen af ​​CA-isoformer i urinen hos fuldbårne nyfødte indlagt til Evelinas børn Hospital. Kohorten omfattede kontroller, der ikke var mistænkt for at gennemgå hæmolyse (ud over den milde fysiologiske form) samt babyer med ABO-inkompatibilitet, anæmi og under behandling for gulsot. URICA-forsøget opnåede etisk godkendelse den 12. maj 2015 (REC: 15/NS/0042). Indsamling og analyse af prøver blev afsluttet i juni 2017. Målinger på urin består af western blotting for CAI (en følsom, men semikvantitativ metode), ELISA for CAI (en kvantitativ metode til bestemmelse af CAI-niveauer), massespecifikation til opnåelse af urinens proteom, plus målinger af totalt protein og kreatinin ( at vurdere evidens for nyresvigt som et eksklusionskriterium). Derudover blev der indsamlet kliniske data om graviditet og blodhæmoglobin, serum eller transkutan bilirubin og C-reaktivt protein på flere tidspunkter, hvor det var muligt, for at teste for henholdsvis anæmi, gulsot og infektion. 26 babyer blev rekrutteret.

Resultater af URICA-studiet: Western blotting viste intet påvisbart CAI-signal i 9 prøver (kan ikke skelnes fra baggrundssignal i voksenurin) og en række positive signaler i 17 prøver. Disse resultater blev understøttet af ELISA-målinger. To prøver havde forhøjede protein/kreatinin-niveauer, hvilket muligvis tyder på nyreskade, men disse producerede ikke CAI-positiv urin. Massespecifikationsanalyse viste, at CAI-niveau ikke korrelerede med noget andet protein i røde blodlegemer, hvilket kraftigt indikerer, at hæmolysen var sket inde i kar og ikke i urinvejene (hvor det også ville føre til signaler fra f.eks. hæmoglobin eller anionbytter 1). Sammenlignet med CAI-negativ urin var det mest over-bundne protein i CAI-positive prøver i virkeligheden CAI, hvilket argumenterede for denne biomarkørs fremragende opløsningsevne. Når man overvejer det tidspunkt, hvor urinen blev opsamlet, er det muligt at forklare CAI-signalet i forhold til bilirubinmålinger som følger:

• Seks babyer med undertærskelværdier for bilirubin (NHS retningslinjer for fototerapi) producerede CAI-negativ urin;
• Hos seksten babyer med hurtigt og signifikant stigende bilirubinniveauer (hvoraf 14 modtog fototerapi), var CAI-signalet stærkest i urinprøver, der blev opsamlet tættere på bilirubin-toppen, med en tendens til at antyde, at CAI-spidsen gik forud for bilirubin-toppen;
• Fire babyer producerede urin med et meget stærkt CAI-signal, men viste ikke forhøjet bilirubin, hvilket argumenterede for, at en særskilt mekanisme producerer hæmolyse.

Hypoteser: Vi foreslår, at urin-CAI er en biomarkør for hæmolyse, og vi antager, at:

1. Urin-CAI-signal kan stratificeres til at relatere til den underliggende hæmolytiske tilstand:

   • ikke påviselig: indikerer ingen tegn på hæmolyse;
   • mellemliggende: niveauer, der indikerer hæmolyse hos babyer med gulsot;
   • højere tærskel: indikerer en akut hæmolytisk krise, som muligvis ikke fremkalder en stigning i bilirubin.
2. I det mellemliggende område går et positivt urin-CAI-signal forud for toppen af ​​bilirubin og er en tidlig indikator for gulsot.

5 Forsøgsmål og formål

Tidsforløbet for bilirubin bruges i øjeblikket til at måle neonatal sundhed, men vi foreslår, at urin-CAI-monitorering vil give et tidligt advarselssignal til at identificere risikopatienter og dermed give neonatalafdelinger mulighed for bedre at rationalisere deres ressourcer. For at fastslå anvendeligheden af ​​denne biomarkør foreslår vi at foretage en longitudinel undersøgelse af en kohorte af fuldbårne babyer for at korrelere tidsforløbene af urin-CAI med bilirubin (for at teste hypotese 2) og for at opnå klinisk information, der kan bestemme årsagen og omfanget af hæmolyse (for at informere tærskelniveauer for hypotese 1).

Forskningsplan: Der er 9.000 fødsler om året på St. Thomas'. Af disse bliver ~1000 babyer indlagt på Neonatal Intensive Care Unit (NICU) hvert år; omkring halvdelen af ​​disse babyer bliver født til termin. Ca. ~300 vil have gulsot, der har behov for fototerapi, og ~10-20 vil have svær hæmolyse (typisk ABO-inkompatibilitet). Målet er at rekruttere 30 fuldbårne børn over en periode på højst 24 måneder, som forventes at blive på neonatalafdelingen i mindst fem dage og op til 10 dage, hvor urinprøver vil blive taget så regelmæssigt som muligt (en gang om dagen; hvis det ikke er muligt, så mindst en gang hver anden dag), tidsstemplet og opbevaret i en dedikeret fryser til off-line analyse i Oxford, når rekrutteringen er afsluttet. Når det er muligt at udføre tæt på opsamlingspunktet, vil et lille volumen urin (ikke mere end fire dråber) blive pipetteret på en lateral flow-enhed (LFD), der leveres som en del af et kit, for at opnå en øjeblikkelig aflæsning af CAI-immunreaktivitet . LFD skal mærkes med den matchende urinidentifikator og registreres (positiv/negativ/ugyldig). Hvis det ikke er muligt i nærheden af ​​indsamlingsstedet, vil dette trin blive udført senere, i Oxford, på optøede prøver. Inden for 6 timer efter urinprøven vil et ikke-invasivt transkutant bilirubinniveau blive opnået og registreret. Disse data vil blive suppleret med følgende information, indhentet som en del af den normale kliniske praksis, der ikke er relateret til forsøgets formål.

• Serumbilirubin blev rutinemæssigt opsamlet
• Blodhæmoglobin og fuld blodtælling
• C-reaktivt protein (CRP) og nyrefunktion
• Svangerskabsalder;
• Varighed og tidspunkt for fototerapi
• Fødselsvægt
• Køn
• Resultat af direkte Coombs-test;
• Årsag til at blive indlagt på NICU.

Urinprøver vil blive analyseret i Oxford i form af:

• CAI-immunreaktivitet på western blot, en meget følsom semi-kvantitativ metode;
• CAI-immunreaktivitet ved ELISA, en kvantitativ metode;
• Totalt protein og kreatinin som markører for nyreskade;
• Osmolaritet, for at bestemme diuretisk tilstand. Alle prøver vil blive anonymiseret med en alfanumerisk kode og knyttet til kliniske data. Babyer, fra hvem der er opnået mindre end 4 urinprøver, vil blive udelukket fra undersøgelsen på grundlag af, at sådanne datasæt ikke ville have den opløsningsevne, der er til at teste hypoteserne. Rekruttering afsluttes, når 30 babyer med mindst 4 prøver er blevet rekrutteret. Babyer med kromosomafvigelser vil også blive udelukket fra undersøgelsen.