急性リンパ芽球性白血病のインドの小児におけるファーマコゲノミクス関連研究 (MPGx-INDALL)

主な目的:

1. つらら治療プロトコルを受けているALLの小児における静的生殖細胞多様体と初期の化学療法関連毒性（治療関連毒性）との関連を研究すること。
2. グルココルチコイド応答の有効性と毒性にそれぞれ関連する体細胞および生殖細胞の遺伝子マーカーを調査すること。
3. 治療プロトコルの有効性と毒性のバイオマーカーを開発するために、将来の関連分析のために生物学的サンプルと臨床データをバイオバンクに保管すること。

副次的な目的:

1. アクティブなALL治療中の生活の質に対する早期毒性の発生の影響を研究する（PedsQLツールを使用した身体的および感情的な生活の質）。
2. 全生存率、非再発死亡率、無再発生存率、および無イベント生存率との遺伝的関連性 (体細胞および生殖細胞系) を評価すること。

臨床転帰:

すべてのデータは、プロジェクト内で雇用されている研究看護師および上級研究員の助けを借りて、センターの臨床研究アシスタントまたはデータマネージャーによって、電子症例報告フォーム (CRF) または最初の紙ベースのフォームに直接記録されます。 各センターの臨床研究者は、計画されたセンター間およびサードパーティのデータ監視を使用して、フォームを電子的にチェックし、日付を記入し、署名します。 すべての患者データは仮名で保存されます。 研究の目的に関連する臨床データが共有されます (例: 人口統計、疾患分類、微小残存病変 (MRD) 検査、細胞遺伝学、フォローアップの詳細、毒性データ、生存データ、再発データ、肝機能検査、早期治療関連毒性）。 これには、導入の初日から維持療法の途中までに発生するグレード 3 以上の薬物関連毒性も含まれます。

維持療法中の TRT は、主に維持療法または継続療法の開始から最初の 100 日以内に発生する血液毒性および肝毒性であり、どちらが先に発生したかを発生率分析に使用します。 毒性は、有害事象の共通用語基準 (CTCAE-バージョン 5.0 - https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm#ctc_50) を使用して等級付けされます。 同じ患者の複数のイベントも分析のために記録されます。 MRD、1 週間 (前期) での疾患反応、およびステロイド療法終了時の疾患反応に関するデータは、体細胞遺伝的バリアントに関連して評価されます。

遺伝子マーカーに関連して評価されるその他の臨床転帰は、疾患の再発率（すなわち、完全寛解の日から再発発生日までの期間）、非再発死亡率（特定の原因以外の原因による死亡）です。疾患の再発)、および全生存期間 (OS)。 OSやRFSなどの転帰を評価するために、最低1年間の追跡調査が行われます（ただし、すべての患者は引き続き追跡され、生存転帰について治療後5年で再度分析されます）。 EFS は、治療開始から最初の導入失敗、無反応、または疾患の進行、何らかの原因による死亡、または最後のフォローアップの日に打ち切られるまでの時間として定義されます。 OS は、治療開始から何らかの原因による死亡までの時間として定義されます。 Jawaharlal Institute of Post Graduate Medical Education and Research (JIPMER) および All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) の患者は、診断時および約 100 日目 (+/-30 日) に QOL アンケートに回答します。小児生活の質のインベントリ、PedsQL (https://www.pedsql.org /）。 pedSQl アンケートのがんモジュールは、ライセンスを取得してこれらのアンケートを提供している Mapi 研究トラストによるガイドラインに従って、最初の患者の募集時までに準備ができていれば実装されます (https://eprovide.mapi-trust.org)。 /）。 それ以外の場合は、汎用モジュールが実装されます。 社会経済データや栄養状態データなどのその他のデータが収集され (「CRF」とともに Web ポータルにアップロードされます)、定期的な標準治療プロトコルの一部として実施される栄養に関する推奨事項が抽出され、治療時に使用されます。それらが調査中の結果のいずれかに交絡因子として影響を与えるかどうかの分析

サンプリング手順:

動員時の唾液サンプル、完全寛解時に全血サンプル (3 ～ 5 ml) を採取し、EDTA チューブに採取して、抽出まで -80 °C で凍結します。 骨髄サンプルも EDTA チューブに採取し、MRD 検査後に残ったサンプルと同様に、抽出まで -80°C で凍結保存します。 血漿サンプルも EDTA 採血管に採取し、相対遠心力 1300g の速度で 10 分間回転するスイングバケット遠心機を使用して血漿分離を行います (4 ml 全血サンプル)。 血漿の 250 μ L の因数は-80 ° C で事前にラベル付けされたクライオ チューブに保存されます。

DNA 抽出はバッチで実行され、アリコートはシーケンス解析のためにジュネーブ チームと共有されます。 DNA 濃度は Qubit または別の SYBR Green ベースの方法を使用して決定され、完全性は Tapestation を使用して測定され、7.5 を超える GQN 値が遺伝子解析に使用されます。 精製および定量プロセスは、JIPMER センターと AIIMS センターの両方ですでに確立されています。 残りのアリコートは、それぞれのバイオバンクに保存されます。 手書きのラベルは受け付けません。すべてのラベルには、匿名化された患者 ID、サンプルの種類、採取時刻が正しく印刷されます。 各センターは、共有分析のためにサンプルを送信する前に、サンプルの匿名化を保証します。 2 つのアリコート、それぞれ約 1.0 μg の DNA を含む 50 μl の 10 mM Tris (8.0) を、ジュネーブでの第 1 相解析におけるシーケンシング (生殖細胞系 70X、体細胞系 150X) およびリアルタイム PCR ジェノタイピングまたはオープン アレイ ジェノタイピングに使用します。インドで第 2 相分析中。 他のアリコートは、将来の調査のためにそれぞれのセンターのバイオバンクに保存されます。

全エクソームシーケンスを使用した第 1 相遺伝子バリアント解析:

全エクソーム配列決定は、ジュネーブ大学の Campus Biotech's Genomics Platform で実施されます。100 の生殖細胞系 DNA サンプルと 100 の白血病細胞 (同じ患者) からの DNA サンプルを使用して、全エクソーム配列決定では、メーカーのプロトコルに従って次のワークフローが使用されます。 i) ライブラリの準備; (ii) HiSeq4000 システムを使用したシーケンス。生殖細胞系 DNA サンプルでは 70X、体細胞 DNA サンプルでは 150X の平均カバレッジ (イルミナ)。 (iii) 生データの統合と、ジュネーブ大学の小児科、婦人科、および産科の小児腫瘍血液学研究プラットフォームの研究所情報管理システム (LIMS) での保存。 データは、LIMS を介してスイスのバイオインフォマティクス研究所と共有され、分析への追加の入力 (分析は主にポスドク研究員によって行われます) と、将来の調査のために JIPMER および AIIMS と共有されます。

遺伝子データ解析:

遺伝子データ解析では、Burrows-Wheeler アライナーを使用して全ゲノムを hg19 参照ゲノムと整列させ、PICARD ツールを使用して PCR 重複を除去し、Genome Analysis Toolkit (GATK) を使用して基本品質スコアの再キャリブレーションを実行します。 クリーンアップされた BAM ファイルは、SAM ツールを使用してパイルアップ ファイルを作成するために使用されます。 生殖系列バリアントは GATK ハプロタイプ コーラーを使用して呼び出され、バリアントの品質スコアはバリアント再調整ツールを使用して公開データ セットに基づいて再調整され、ANNOVAR を使用して注釈が付けられます。 次に、非白血病バリアントを白血病バリアントから単純に差し引いて、白血病固有のバリアント リストを取得します。 Varscan および Mu Tect ツールで利用可能なヒューリスティックな方法を使用して、白血病および非白血病シーケンスも同時に分析され、突然変異を検出します。 シーケンス エラーが原因で発生する可能性のあるバリアントは、SAVI アルゴリズムによって検出されます。 (i) 仮説に基づいて選択された遺伝子へのフィルター処理されたバリアント/変異を使用した候補遺伝子アプローチ、および (ii) バリアントに焦点を当てた、仮説のないエクソーム全体の関連分析を介して分析を実行します。エクソン領域に位置し、機能的効果が予測されるミスセンスまたはナンセンスバリアント、およびスプライシング部位のバリエーション。 タンパク質機能に対するミスセンス バリアントの予測される影響は、VEP ツールに組み込まれた SIFT および PolyPhen2 を使用してインシリコで評価されます。 バリアント フィルタリングは、1000 ゲノムおよび NHLBI GO Exome Sequencing プロジェクトに基づいて実行されます。 フィッシャーの正確確率検定 (対立遺伝子関連) および傾向に関するコクラン-アーミテージ検定が PLINK に実装され、臨床転帰と遺伝的変異との間の関連性が検索されます。

定量的およびバイナリ データの関連付け分析は、PLINK の一般的な線形化モデルを使用して分析されます。有意なしきい値は、候補およびエクソーム全体のアプローチのバリアント数あたり 0.05 です。 p値が0.05の代替分析が設定され、Benjamin-Hochberg誤検出率法を使用して複数のテストの調整が実行されます:バリアントは、誤検出率が5%未満の場合、有意に関連しているとみなされます( EWAS の場合) または 10% (候補遺伝子解析の場合)。

候補遺伝子の選択 :

薬理遺伝学的バリアントは、治療プロトコル (主に PharmGKB から入手) における化学療法薬の動態と動態に影響を与えると仮定されています。 毒性の病態生理学に寄与する生理学的機能に影響を与える可能性のある他の薬理遺伝子も含まれます。 マイナー アレル頻度が 15% を超える場合、分析のためのバリアント フィルタリングの基準としての機能が実装されます。 潜在的な候補のリストは、付録「Germline_Genes.txt」に記載されています。

体細胞変異検査のための候補遺伝子の選択: 一連の候補遺伝子は、広範な文献レビューに従って編集されました。 これらの遺伝子は、次の理由で選択されました。i）個々の関連研究によって報告されました。 ii) ステロイド療法および他の化学療法剤の薬力学的経路に参加する。 iii) 疾患の病因または疾患制御の免疫学的経路における主要なアクターである。 iv) 化学療法と放射線による損傷の修復に参加する。 v) 私たちの共同研究者でありメンターである Maja Krajinovic 教授の研究室で行われた実験では、プレドニゾロンに感受性または耐性のリンパ芽球様細胞でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされました。 vi) ステロイド、化学療法、およびその他の支持療法に特化した Ingenuity Pathway Analysis® を介して取得できます。 関連性を見つけるために、これらの遺伝子のバリアントのみが統計分析に投入されます。 いくつかの候補を選択するために、特定の表現型について、英国のバイオバンク (サブセットのインド人集団) からの固有の集団データセットも利用されます。 体細胞バリアントの場合、DepMap や TARGET データなどの公開データ リポジトリが考慮されます。 したがって、候補遺伝子のセットにより、単一の研究からすべて取得された、その臨床および追跡データとともに、単一民族の白血病配列決定データベースの作成が可能になります。 これは、子供のすべての治療に関連する質問を調査している研究者にとって貴重なリソースとして役立ちます。

全エクソームシーケンスによって検出された体細胞および生殖細胞変異体の候補は、PCR 増幅後の直接サンガーシーケンスを使用して検証されます。 主要なクローン集団に存在する場合、サンガー配列決定により、ヘテロ接合状態の変異の検出が可能になります。 したがって、読み取りの < 25% で報告された変異は、この検証フェーズには含まれません。

フェーズ 1 分析から選択された候補のフェーズ 2 ジェノタイピング:

フェーズ 2 の分析には、TRT を使用したフェーズ 1 の生殖細胞系配列決定関連解析で特定された上位 120 の候補からの 400 の生殖細胞系 DNA サンプルのスクリーニングが含まれます。 体細胞 DNA 分析には、フェーズ 1 分析の上位 100 候補からの 150 サンプルのスクリーニングが含まれます。 費用対効果の高い戦略として、オープン アレイ手法 (ThermoScientific) またはカスタムメイドのマイクロ アレイ (Axiom) を使用できます。 我々は、例えば、対立遺伝子特異的PCRまたは単純なプローブベースの対立遺伝子識別アッセイまたは高解像度メルトカーブ分析法など、調査された臨床転帰に最も関連するバリアントのルーチンモニタリングのために実装しやすい費用対効果の高いスクリーニング方法を開発する予定です。 . 生成されたデータは、JIPMER と AIIMS の永続的なデータ リポジトリにローカルに保存され、ジュネーブの小児腫瘍血液学研究プラットフォームとも共有されます。 Clinical Pharmacogenomics Implementation Consortium®（CPIC）運営委員会との間で、この研究で生成された薬理遺伝学的データを使用して、インドの患者集団により適切な遺伝子検査を評価することについて合意が締結され、集団固有のパネルの開発が可能になります。将来は

血漿または全血/赤血球中の薬物レベルの測定 (オプション):

定期的な治療薬モニタリング サービスから得られた分析データも収集され、遺伝子変異と臨床転帰に関連して分析されます。 血漿サンプルまたは全血サンプルは、ELISA または LC-MS/MS ベースの分析方法を使用して薬物レベルおよび活性を監視するための誘導および維持中に定期的に収集されます。 これにより、薬物レベルとは無関係に遺伝的素因を評価することもできます。 L-アスパラギナーゼの活性レベルは、最初の注入後 3 日目に収集された血漿から (ELISA を使用して) 測定されます。 6-メルカプトプリンについては、維持療法の8週間(すなわち、49日目から56日目)の間に全血サンプルが採取され、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、および6-メチルメルカプトプリンのレベルがRBCで測定されます。 メトトレキサート導入療法中は、注入終了から 48 時間後に全血サンプルが採取されます。 メトトレキサート維持療法中、7週目にサンプルを採取し、その代謝物を分析します。 導入中のビンクリスチンについては、注入終了から 24 時間後にサンプルを採取しました。

将来の研究のための血漿タンパク質マーカー分析と生物学的材料リポジトリ:

この部分は、現在の研究助成金申請では予定されていませんが、サンプルバンキングが行われます。 将来の別のプロジェクトまたは現在の研究プロジェクトの継続として、Olink Proteomics AB (スウェーデンのウプサラ大学からスピンアウト) によって開発された Proximity Extension Assay (PEA) を使用して、184 の腫瘍学、細胞増殖、および免疫学を同時に定量化します。関連するヒトタンパク質バイオマーカー（この分野の専門家からのインプットと病態生理学における彼らの役割に基づいて選択される）。 このアッセイに必要な血漿または血液のサンプルは 10 μL 未満で、92 のタンパク質バイオマーカーのパネルと 3 つの内部コントロール サンプルを一度に測定できます。 このアッセイは、個別に選択された各パネルの 96 ウェル プレートを使用して実行され、洗浄手順は必要ありません。 結果を正確に予測するマルチマーカー スコアの能力は、受信者動作特性 (ROC) 曲線と感度および特異度の分析を使用して検出されます。