Estudio de asociación farmacogenómica en niños indios con leucemia linfoblástica aguda (MPGx-INDALL)

Objetivos principales:

1. Estudiar las asociaciones de variantes germinales estáticas con toxicidades tempranas relacionadas con la quimioterapia (toxicidades relacionadas con el tratamiento) en niños con LLA que se someten al protocolo de tratamiento Icicle.
2. Investigar los marcadores genéticos somáticos y de línea germinal asociados con la eficacia y toxicidad de la respuesta a los glucocorticoides, respectivamente.
3. Biobanco de muestras biológicas y datos clínicos para futuros análisis de asociación con el fin de desarrollar biomarcadores de eficacia y toxicidad del protocolo de tratamiento.

Objetivos secundarios:

1. Estudiar el impacto de la aparición de toxicidades tempranas en la calidad de vida durante el tratamiento activo de la LLA (calidad de vida física y emocional mediante la herramienta PedsQL).
2. Evaluar las asociaciones genéticas (somáticas y de línea germinal) con la supervivencia global, la mortalidad sin recaídas, la supervivencia sin recaídas y la supervivencia sin eventos.

Resultados clínicos:

Todos los datos se registrarán directamente en un Formulario de informe de caso electrónico (CRF) o en formularios iniciales en papel por el asistente de investigación clínica o el administrador de datos del centro con la ayuda de la enfermera de investigación y el investigador principal empleado en el proyecto. El investigador clínico de cada centro verificará, fechará y firmará los formularios electrónicamente, con un monitoreo de datos planificado entre centros y de terceros. Todos los datos de los pacientes se guardarán bajo un seudónimo. Se compartirán datos clínicos relevantes para los objetivos del estudio (p. ej., datos demográficos, clasificación de enfermedades, pruebas de enfermedad residual mínima (MRD), citogenética, detalles de seguimiento, datos de toxicidad, datos de supervivencia, datos de recaídas, pruebas de función hepática, pruebas relacionadas con el tratamiento temprano) toxicidades). Esto también incluirá cualquier toxicidad relacionada con el fármaco ≥ grado 3 que ocurra desde el primer día de inducción hasta la mitad de la terapia de mantenimiento.

Los TRT durante la terapia de mantenimiento son principalmente toxicidades hematológicas y hepáticas que ocurren dentro de los primeros 100 días del inicio del tratamiento de mantenimiento o continuación, y lo que ocurra primero se utilizará para el análisis de incidencia. Las toxicidades se calificarán utilizando los Criterios de Terminología Común para Eventos Adversos (CTCAE-versión 5.0 - https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm#ctc_50. También se registrarán múltiples eventos para el mismo paciente para su análisis. Los datos sobre MRD, la respuesta de la enfermedad a la semana (profase) y la respuesta de la enfermedad al final de la terapia con esteroides se evaluarán en relación con las variantes genéticas somáticas.

Otros resultados clínicos que deben evaluarse en relación con los marcadores genéticos son la incidencia de recaída de la enfermedad (es decir, la duración entre el día de la remisión completa y el día en que ocurre la recaída), la mortalidad sin recaída (muerte por cualquier causa que no sea una recidiva de la enfermedad) y supervivencia global (SG). Habrá un seguimiento mínimo de un año (sin embargo, todos los pacientes seguirán siendo seguidos y se analizarán nuevamente a los 5 años después del tratamiento para determinar los resultados de supervivencia) para evaluar resultados como la SG y la RFS. La SLE se define como el tiempo desde el inicio del tratamiento hasta el primer fracaso de la inducción, la falta de respuesta o la progresión de la enfermedad, la muerte por cualquier causa o se censura en la fecha del último seguimiento. OS se define como el tiempo desde el inicio de la terapia hasta la muerte por cualquier causa. Los pacientes del Instituto Jawaharlal de Educación e Investigación Médica de Posgrado (JIPMER) y el Instituto de Ciencias Médicas de la India (AIIMS) responderán a un cuestionario de calidad de vida en el momento del diagnóstico y alrededor del día 100 (+/- 30 días) de la fase de mantenimiento (se evaluarían otros puntos de tiempo durante la terapia de mantenimiento pero no bajo el alcance de la propuesta de investigación actual), utilizando las escalas básicas genéricas del inventario de calidad de vida pediátrica, PedsQL (https://www.pedsql.org /). El módulo de cáncer del cuestionario pedSQl se implementará si está listo para el momento del reclutamiento del primer paciente según las pautas de Mapi Research Trust, que proporciona estos cuestionarios al obtener la licencia (https://eprovide.mapi-trust.org). /). De lo contrario, se implementará el módulo genérico. Se recopilarán otros datos, como datos sobre el estado socioeconómico y nutricional (cargados en el portal web junto con "CRF"), y se extraerán y utilizarán las recomendaciones nutricionales implementadas como parte del protocolo de tratamiento estándar de rutina en el momento de la análisis si tienen un impacto como factores de confusión en cualquiera de los resultados bajo investigación

Procedimiento de muestreo:

Muestras de saliva en el momento del reclutamiento, la muestra de sangre completa (3-5 ml) se recolecta en remisión completa, recolectada en tubos EDTA y se mantendrá congelada a -80 ° C hasta la extracción. Las muestras de médula ósea también se recolectarán en tubos con EDTA y se mantendrán congeladas a -80 °C hasta la extracción, al igual que las muestras sobrantes después de la prueba de MRD. Las muestras de plasma también se recolectarán en tubos de recolección de sangre con EDTA y se realizará la separación del plasma (4 ml de muestra de sangre completa) utilizando una centrífuga de cubeta oscilante que gira durante 10 minutos a una velocidad de 1300 g de fuerza centrífuga relativa. Se almacenarán alícuotas de 250 µL de plasma a -80 °C en criotubos preetiquetados.

La extracción de ADN se realizará por lotes y se compartirá una alícuota con el equipo de Ginebra para los análisis de secuenciación. Las concentraciones de ADN se determinarán mediante Qubit u otro método basado en SYBR Green, y la integridad se medirá mediante Tapestation, con valores de GQN superiores a 7,5 que se utilizarán para los análisis genéticos. Ya se han establecido procesos de purificación y cuantificación tanto en los centros JIPMER como en AIIMS. Las alícuotas restantes se almacenarán en sus respectivos biobancos. No se aceptarán etiquetas manuscritas; todas las etiquetas estarán debidamente impresas con una identificación de paciente anonimizada, tipo de muestra y hora de recolección. Cada centro garantizará la anonimización de las muestras antes de enviar las muestras para análisis compartidos. Se utilizarán dos alícuotas, cada una con aproximadamente 1,0 µg de ADN en 50 µl 10 mM de Tris (8.0), para la secuenciación (germline 70X, somatic 150X) en el análisis de fase 1 en Ginebra y para el genotipado de PCR en tiempo real o el genotipado de matriz abierta en análisis de fase 2 en India. Otras alícuotas se almacenarían en biobancos en los respectivos centros para futuras investigaciones.

Análisis de variantes genéticas de fase 1 mediante secuenciación del exoma completo:

La secuenciación del exoma completo se realizará en la Plataforma de Genómica de Campus Biotech en la Universidad de Ginebra Utilizando 100 muestras de ADN de línea germinal y 100 muestras de ADN de células leucémicas (los mismos pacientes), la secuenciación del exoma completo utilizará el siguiente flujo de trabajo de acuerdo con los protocolos de los fabricantes: ( i) preparación de bibliotecas; (ii) secuenciación utilizando un sistema HiSeq4000 con una cobertura media de 70X para muestras de ADN de línea germinal y 150X para muestras de ADN somático (Illumina); (iii) integración y almacenamiento de datos sin procesar en el Sistema de Gestión de Información de Laboratorio (LIMS) en la Plataforma de Investigación de Onco-Hematología Pediátrica del Departamento de Pediatría, Ginecología y Obstetricia de la Universidad de Ginebra. Los datos se compartirán con el Instituto Suizo de Bioinformática a través de LIMS, para obtener información adicional sobre el análisis (los análisis serán realizados principalmente por un becario postdoctoral), y con JIPMER y AIIMS para futuras investigaciones.

Análisis de datos genéticos:

Para el análisis de datos genéticos, los genomas completos se alinearán con el genoma de referencia hg19 mediante un alineador Burrows-Wheeler, los duplicados de PCR se eliminarán mediante herramientas PICARD y las recalibraciones de la puntuación de calidad base se realizarán mediante el kit de herramientas de análisis del genoma (GATK). Los archivos BAM limpios se utilizarán para crear archivos de acumulación con la herramienta SAM. Las variantes de la línea germinal se llamarán mediante un llamador de haplotipos GATK, y los puntajes de calidad de las variantes se recalibrarán en función de los conjuntos de datos públicos mediante la herramienta Variant Recalibrate y se anotarán mediante ANNOVAR. A continuación, las variantes no leucémicas simplemente se restarán de las variantes leucémicas para obtener una lista de variantes leucémicas específicas. Las secuencias leucémicas y no leucémicas también se analizarán simultáneamente para detectar mutaciones utilizando los métodos heurísticos disponibles en las herramientas Varscan y Mu Tect. Las variantes que puedan surgir debido a errores de secuencia serán detectadas por el algoritmo SAVI. Realizaremos el análisis a través de (i) un enfoque de gen candidato con variantes/mutaciones filtradas en los genes seleccionados en función de una hipótesis, y (ii) análisis de asociación sin hipótesis, en todo el exoma, cuyo enfoque estará en las variantes. ubicados en regiones exónicas, variantes sin sentido o sin sentido con efecto funcional predicho, así como variaciones en los sitios de empalme. Los efectos previstos de las variantes sin sentido sobre la función de la proteína se evaluarán in silico utilizando SIFT y PolyPhen2 incorporados en las herramientas VEP. El filtrado de variantes se realizará en función de los proyectos 1000 Genomes y NHLBI GO Exome Sequencing. La prueba exacta de Fisher (asociación alélica) y la prueba de tendencias de Cochran-Armitage se implementarán en PLINK para buscar asociaciones entre resultados clínicos y variantes genéticas.

El análisis de asociación para datos cuantitativos y binarios se analizará mediante modelos lineales generales en PLINK, con un umbral de significación de 0,05 por número de variantes para los enfoques candidatos y de todo el exoma. Se establecerán análisis alternativos con un valor p de 0,05 y se realizarán ajustes para pruebas múltiples utilizando el método de tasa de descubrimiento falso de Benjamin-Hochberg: las variantes se consideran significativamente asociadas si tienen una tasa de descubrimiento falso inferior al 5 % ( para EWAS) o 10% (para análisis de genes candidatos).

Selección de genes candidatos:

Se supone que las variantes farmacogenéticas afectan la cinética y la dinámica de los fármacos quimioterapéuticos en el protocolo de tratamiento (principalmente obtenidos de PharmGKB). También se incluirían otros farmacogenes que podrían tener un impacto en las funciones fisiológicas que contribuyen a la fisiopatología de las toxicidades. Frecuencia de alelos menores por encima del 15%, se implementaría la funcionalidad como criterio de filtrado de variantes para el análisis. En el anexo "Germline_Genes.txt" se proporciona una lista de candidatos potenciales.

Selección de genes candidatos para pruebas de variantes somáticas: se compiló un conjunto de genes candidatos tras una extensa revisión de la literatura. Estos genes fueron seleccionados porque: i) fueron informados por estudios de asociación individuales; ii) participar en las vías farmacodinámicas de las terapias con esteroides y otros agentes quimioterapéuticos; iii) son actores clave en la patogénesis de la enfermedad o en las vías inmunológicas de control de la enfermedad; iv) participar en la reparación de los daños causados ​​por la quimioterapia y la radiación; v) se regularon hacia arriba o hacia abajo en células linfoblastoides sensibles o resistentes a la prednisolona en los experimentos realizados en el laboratorio de nuestra colaboradora y mentora, la Prof. Maja Krajinovic; vi) puede obtenerse a través de Ingenuity Pathway Analysis® específico para esteroides, quimioterapia y otras terapias de atención de apoyo. Solo las variantes de estos genes se incluirán en el análisis estadístico para encontrar asociaciones. También se utilizarán conjuntos de datos de población únicos del biobanco del Reino Unido (subconjunto de la población india) para el fenotipo específico para seleccionar algunos de los candidatos. Para las variantes somáticas, se considerarían repositorios de datos públicos como DepMap y TARGET. El conjunto de genes candidatos permitirá así la creación de una base de datos de secuenciación de leucemias de una sola etnia, junto con sus datos clínicos y de seguimiento, todos obtenidos de un único estudio. Esto servirá como un recurso valioso para los investigadores que investigan cuestiones relacionadas con TODOS los tratamientos en niños.

Las variantes somáticas y de línea germinal candidatas detectadas mediante la secuenciación del exoma completo se validarán mediante la secuenciación directa de Sanger después de la amplificación por PCR. Cuando está presente en una población clonal importante, la secuenciación de Sanger permite la detección de mutaciones en estados heterocigóticos. Por lo tanto, las mutaciones notificadas en < 25 % de las lecturas no se incluirán en esta fase de validación.

Genotipado de fase 2 para candidatos seleccionados del análisis de fase 1:

Los análisis de la fase 2 incluirán la detección de 400 muestras de ADN de la línea germinal de los 120 candidatos principales identificados en el análisis de asociación de secuenciación de la línea germinal de la fase 1 con TRT. El análisis de ADN somático incluye la selección de 150 muestras de los 100 mejores candidatos del análisis de fase 1. Una metodología de matriz abierta (ThermoScientific) o micromatrices hechas a la medida (Axiom) podrían usarse como una estrategia rentable. Planeamos desarrollar una metodología de detección rentable que sea fácil de implementar para el monitoreo de rutina de las variantes más asociadas con los resultados clínicos investigados, por ejemplo, PCR específica de alelo o ensayos simples de discriminación de alelo basados ​​en sonda o métodos de análisis de curva de fusión de alta resolución. . Los datos generados se almacenarán localmente en los repositorios de datos permanentes de JIPMER y AIIMS y también se compartirán con la Plataforma de Investigación de Onco-Hematología Pediátrica de Ginebra. Se firmará un acuerdo con el comité directivo del Consorcio de Implementación de Farmacogenómica Clínica® (CPIC) sobre el uso de los datos farmacogenéticos generados en este estudio para evaluar qué pruebas genéticas serían más apropiadas para la población de pacientes de la India, lo que permitirá el desarrollo de paneles específicos de la población. en el futuro

Medición de los niveles de fármaco en plasma o sangre total/glóbulos rojos (Opcional):

Los datos analíticos obtenidos de los servicios de monitorización de fármacos terapéuticos de rutina también se recopilarán y analizarán en relación con las variantes genéticas y los resultados clínicos. Las muestras de plasma o las muestras de sangre total se recolectarán de forma rutinaria durante la inducción y el mantenimiento para monitorear los niveles y la actividad del fármaco mediante métodos analíticos basados ​​en ELISA o LC-MS/MS. Esto también nos permitirá evaluar las predisposiciones genéticas independientemente de los niveles de fármaco. El nivel de actividad de L-asparaginasa se medirá (mediante ELISA) a partir del plasma recogido el día 3 después de la primera infusión. Para la 6-mercaptopurina, se recolectarán muestras de sangre completa durante las ocho semanas de la terapia de mantenimiento (es decir, entre los días 49 y 56) y se medirán los niveles de 6-mercaptopurina, 6-tioguanina y 6-metilmercaptopurina en los glóbulos rojos. Durante la terapia de inducción con metotrexato, se tomarán muestras de sangre completa 48 horas después del final de la infusión. Durante la terapia de mantenimiento con metotrexato, se tomarán muestras durante la semana 7 y se analizarán sus metabolitos. Para la vincristina durante la inducción, las muestras se recogieron 24 horas después del final de la infusión.

Análisis de marcadores de proteínas plasmáticas y depósito de material biológico para estudios futuros:

No está previsto que esta parte se lleve a cabo bajo la solicitud de subvención de investigación actual, sin embargo, se realizará un banco de muestras. En un futuro proyecto separado o como continuación del proyecto de investigación actual, el ensayo de extensión de proximidad (PEA) desarrollado por Olink Proteomics AB (separado de la Universidad de Uppsala, Suecia) se utilizará para cuantificar simultáneamente 184 oncología, crecimiento celular e inmunología. biomarcadores de proteínas humanas relacionados (que se elegirán en función de los aportes de los expertos en el campo y sus funciones en la fisiopatología). Este ensayo requiere una muestra de menos de 10 µL de plasma o sangre y puede medir un panel de 92 biomarcadores de proteínas y tres muestras de control interno a la vez. Este ensayo se realizará utilizando una placa de 96 pocillos para cada panel, seleccionados por separado, y no requiere pasos de lavado. La capacidad de la puntuación de múltiples marcadores para predecir con precisión los resultados se detectará utilizando curvas de características operativas del receptor (ROC), junto con análisis de sensibilidad y especificidad.