Farmakogenomická asociační studie u indických dětí s akutní lymfoblastickou leukémií (MPGx-INDALL)

Primární cíle:

1. Studovat asociace statických zárodečných variant s časnými toxicitami souvisejícími s chemoterapií (toxicity související s léčbou) u dětí s ALL podstupujících protokol léčby rampouchy.
2. Prozkoumat somatické a zárodečné genetické markery spojené s účinností a toxicitou glukokortikoidní odpovědi, v daném pořadí.
3. Do biobanky biologických vzorků a klinických dat pro budoucí asociační analýzy s cílem vyvinout biomarkery účinnosti a toxicity léčebného protokolu.

Sekundární cíle:

1. Studovat vliv výskytu časných toxicit na kvalitu života během aktivní léčby ALL (fyzická a emocionální kvalita života pomocí nástroje PedsQL).
2. Vyhodnotit genetické asociace (somatické a zárodečné) s celkovým přežitím, mortalitou bez relapsu, přežitím bez relapsu a přežitím bez příhody.

Klinické výsledky:

Všechna data budou zaznamenána přímo do elektronického formuláře Case Report Form (CRF) nebo do počátečních papírových formulářů asistentem klinického výzkumu centra nebo datovým manažerem s pomocí výzkumné sestry a vedoucího výzkumného pracovníka zaměstnaného v rámci projektu. Klinický zkoušející každého centra elektronicky zkontroluje, datuje a podepíše formuláře s plánovaným monitorováním dat mezi středisky a třetími stranami. Všechna data pacienta budou uložena pod pseudonymem. Budou sdíleny klinické údaje relevantní pro cíle studie (např. demografické údaje, klasifikace onemocnění, testování minimálního reziduálního onemocnění (MRD), cytogenetika, podrobnosti o sledování, údaje o toxicitě, údaje o přežití, údaje o relapsu, testy jaterních funkcí, související s časnou léčbou toxicity). To bude také zahrnovat jakoukoli toxicitu související s lékem ≥ 3. stupně, která se objeví od prvního dne indukce do poloviny udržovací terapie.

TRT během udržovací léčby jsou hlavně hematologické a jaterní toxicity, ke kterým dochází během prvních 100 dnů od zahájení udržovací nebo pokračovací léčby, a podle toho, co nastane dříve, se použije pro analýzu incidence. Toxicita bude hodnocena pomocí společných terminologických kritérií pro nežádoucí účinky (CTCAE-verze 5.0 – https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm#ctc_50. Pro analýzu bude také zaznamenáno více událostí pro stejného pacienta. Údaje o MRD, odpovědi onemocnění po jednom týdnu (profáze) a odpovědi onemocnění na konci terapie steroidy budou hodnoceny ve vztahu k somatickým genetickým variantám.

Další klinické výsledky, které mají být hodnoceny ve vztahu ke genetickým markerům, jsou výskyt relapsu onemocnění (tj. doba mezi dnem úplné remise a dnem výskytu relapsu), mortalita bez relapsu (úmrtí z jakékoli jiné příčiny než relapsu onemocnění) a celkového přežití (OS). Bude následovat minimálně jednoroční sledování (ovšem všichni pacienti budou nadále sledováni a budou znovu analyzováni 5 let po léčbě na výsledky přežití), aby se vyhodnotily výsledky, jako je OS a RFS. EFS je definován jako čas od zahájení léčby do prvního selhání indukce, nereagování nebo progrese onemocnění, úmrtí z jakékoli příčiny nebo je cenzurován k datu poslední kontroly. OS je definován jako doba od zahájení terapie do úmrtí z jakékoli příčiny. Pacienti z Jawaharlal Institute of Postgraduate Medical Education and Research (JIPMER) a All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) odpoví na dotazník kvality života v době diagnózy a přibližně v den 100 (+/-30 dní) udržovací fáze (jiné časové body během udržovací terapie by byly vyhodnoceny, ale ne v rámci současného návrhu výzkumu), za použití obecných základních škál pediatrického inventáře kvality života, PedsQL (https://www.pedsql.org /). Modul Cancer dotazníku pedSQl bude implementován, pokud bude připraven v době náboru prvního pacienta podle pokynů výzkumného fondu Mapi, který tyto dotazníky dodává po získání licence (https://eprovide.mapi-trust.org /). Jinak bude implementován obecný modul. Budou shromažďovány další údaje, jako jsou údaje o socioekonomickém a nutričním stavu (nahrány na webový portál spolu s „CRF“), a nutriční doporučení implementovaná jako součást rutinního standardního léčebného protokolu budou extrahována a použita v době analýzu, pokud mají vliv jako zmatky na některý ze zkoumaných výstupů

Postup odběru vzorků:

Vzorky slin v době náboru, vzorek plné krve (3-5 ml) se odebere v úplné remisi, odebere se do zkumavek s EDTA a bude až do extrakce uchováván zmrazený při -80 °C. Vzorky kostní dřeně budou také odebírány do zkumavek EDTA a udržovány zmrazené při -80 °C až do extrakce, stejně jako vzorky zbylé po testování MRD. Vzorky plazmy budou také odebírány do zkumavek pro odběr krve EDTA a bude provedena separace plazmy (4 ml vzorku plné krve) pomocí kyvné kyblíkové odstředivky rotující po dobu 10 minut při rychlosti 1300 g relativní odstředivé síly. Alikvoty 250 ul plazmy budou skladovány při -80 °C v předem označených kryozkumavkách.

Extrakce DNA bude prováděna v dávkách a alikvotní část bude sdílena s ženevským týmem pro sekvenační analýzy. Koncentrace DNA budou stanoveny pomocí Qubit nebo jiné metody založené na SYBR Green a integrita bude měřena pomocí Tapestation, přičemž pro genetické analýzy budou použity hodnoty GQN vyšší než 7,5. V centrech JIPMER i AIIMS již byly zavedeny procesy čištění a kvantifikace. Zbývající alikvoty budou uloženy v příslušných biobankách. Žádné ručně psané štítky nebudou akceptovány; všechny štítky budou řádně vytištěny s anonymizovaným ID pacienta, typem vzorku a časem odběru. Každé centrum zajistí anonymizaci vzorků před odesláním vzorků ke sdíleným analýzám. Dva alikvoty, každý s přibližně 1,0 µg DNA v 50 µl 10 mM Tris (8,0), budou použity pro sekvenování (zárodečná linie 70X, somatická 150X) ve fázi 1 analýzy v Ženevě a pro genotypování PCR v reálném čase nebo genotypování otevřeného pole ve fázi 2 analýzy v Indii. Jiné alikvoty by byly uloženy v biobankách v příslušných centrech pro budoucí vyšetřování.

Analýza genetické varianty fáze 1 pomocí sekvenování celého exomu:

Sekvenování celého exomu bude provedeno na platformě Campus Biotech's Genomics Platform na univerzitě v Ženevě Za použití 100 vzorků zárodečné DNA a 100 vzorků DNA z leukemických buněk (stejní pacienti) bude sekvenování celého exomu používat následující pracovní postup podle protokolů výrobců: ( i) příprava knihovny; (ii) sekvenování za použití systému HiSeq4000 se středním pokrytím 70X pro vzorky zárodečné DNA a 150X pro vzorky somatické DNA (Illumina); (iii) integrace a ukládání nezpracovaných dat v systému správy laboratorních informací (LIMS) na výzkumné platformě pediatrické onko-hematologie na katedře pediatrie, gynekologie a porodnictví Ženevské univerzity. Data budou sdílena se Švýcarským institutem bioinformatiky prostřednictvím LIMS pro další vstupy do analýzy (analýzy budou prováděny převážně postdoktorandem) as JIPMER a AIIMS pro budoucí vyšetřování.

Analýza genetických dat:

Pro analýzu genetických dat budou celé genomy zarovnány s referenčním genomem hg19 pomocí Burrows-Wheeler aligneru, PCR duplikáty budou odstraněny pomocí nástrojů PICARD a rekalibrace základního skóre kvality budou provedeny pomocí Genome Analysis Toolkit (GATK). Vyčištěné soubory BAM budou použity k vytvoření pile-up souborů pomocí nástroje SAM. Zárodečné varianty budou volány pomocí GATK Haplotype Caller a skóre kvality variant bude rekalibrováno na základě veřejných datových sad pomocí nástroje Variant Recalibrate a anotováno pomocí ANNOVAR. Neleukemické varianty pak budou jednoduše odečteny od leukemických variant, aby se získal seznam specifických leukemických variant. Leukemické a neleukemické sekvence budou také analyzovány současně pro detekci mutací pomocí heuristických metod dostupných v nástrojích Varscan a Mu Tect. Algoritmus SAVI detekuje varianty, které mohou vzniknout v důsledku chyb sekvence. Provedeme analýzu prostřednictvím (i) kandidátního genového přístupu s filtrovanými variantami/mutacemi vybraných genů na základě hypotézy a (ii) bezhypotézovou celoexomovou asociační analýzou, jejíž těžiště bude na varianty lokalizované v exonových oblastech, missense nebo nesmyslné varianty s předpokládaným funkčním účinkem, stejně jako variace v místech sestřihu. Předpokládané účinky missense variant na funkci proteinu budou posouzeny in silico pomocí SIFT a PolyPhen2 začleněných do nástrojů VEP. Filtrování variant bude prováděno na základě projektů 1000 genomů a NHLBI GO Exome Sequencing. Fisherův exaktní test (alelická asociace) a Cochran-Armitageův test trendů budou implementovány v PLINK za účelem hledání asociací mezi klinickými výsledky a genetickými variantami.

Asociační analýza pro kvantitativní a binární data bude analyzována pomocí obecných linearizovaných modelů v PLINK, s prahem významnosti 0,05 na počet variant pro kandidátský a exomový přístup. Budou nastaveny alternativní analýzy s p-hodnotou 0,05 a úpravy pro vícenásobné testování budou provedeny pomocí metody Benjamin-Hochberg false discovery rate: varianty jsou považovány za významně asociované, pokud mají míru falešných objevů nižší než 5 % ( pro EWAS) nebo 10 % (pro analýzu kandidátních genů).

Výběr kandidátského genu:

Předpokládá se, že farmakogenetické varianty ovlivňují kinetiku a dynamiku chemoterapeutických léků v léčebném protokolu (zejména získaném od PharmGKB). Zahrnuty by byly i další farmakogeny, které by mohly mít vliv na fyziologické funkce přispívající k patofyziologii toxicit. Frekvence vedlejších alel nad 15 %, byla by implementována funkce jako kritérium filtrování variant pro analýzu. Seznam potenciálních kandidátů je uveden v příloze „Germline_Genes.txt“.

Selekce kandidátního genu pro testování somatických variant: Sada kandidátních genů byla sestavena po rozsáhlém přehledu literatury. Tyto geny byly vybrány, protože: i) byly hlášeny jednotlivými asociačními studiemi; ii) účastnit se farmakodynamických drah steroidních terapií a jiných chemoterapeutických činidel; iii) jsou klíčovými aktéry v patogenezi onemocnění nebo imunologických drahách kontroly onemocnění; iv) podílet se na nápravě poškození způsobeného chemoterapií a ozařováním; v) byly up- nebo down-regulovány v lymfoblastoidních buňkách citlivých nebo rezistentních na prednisolon v experimentech prováděných v laboratoři naší spolupracovnice a mentorky prof. Maji Krajinovic; vi) lze získat prostřednictvím analýzy Ingenuity Pathway Analysis® specifické pro steroidy, chemoterapii a další podpůrné terapie. Do statistické analýzy za účelem nalezení asociací budou vloženy pouze varianty těchto genů. Unikátní populační datové soubory z britské biobanky (podskupina indická populace) budou také použity pro specifický fenotyp k výběru některých kandidátů. U somatických variant by byla zvážena veřejná úložiště dat, jako jsou data DepMap a TARGET. Sada kandidátních genů tak umožní vytvoření databáze sekvenování leukémie jednoho etnika spolu s jejími klinickými a následnými daty, vše získané z jediné studie. To bude sloužit jako cenný zdroj pro výzkumníky, kteří zkoumají otázky související s léčbou VŠECH u dětí.

Kandidátní somatické a zárodečné varianty detekované sekvenováním celého exomu budou validovány pomocí přímého Sangerova sekvenování po PCR amplifikaci. Pokud je přítomno ve velké klonální populaci, Sangerovo sekvenování umožňuje detekci mutací v heterozygotních stavech. Mutace hlášené u < 25 % odečtů tedy nebudou do této ověřovací fáze zahrnuty.

Genotypizace fáze 2 pro vybrané kandidáty z analýzy fáze 1:

Analýzy fáze 2 budou zahrnovat screening 400 vzorků zárodečné DNA z nejlepších 120 kandidátů identifikovaných ve fázi 1 sekvenční asociační analýzy zárodečné linie s TRT. Somatická analýza DNA zahrnuje screening 150 vzorků od 100 nejlepších kandidátů z analýzy fáze 1. Jako nákladově efektivní strategie by mohla být použita metodika open-array (ThermoScientific) nebo zakázková microarrays (Axiom). Plánujeme vyvinout nákladově efektivní metodologii screeningu, kterou lze snadno implementovat pro rutinní monitorování variant nejvíce spojených s vyšetřovanými klinickými výsledky, např. alelově specifické PCR nebo jednoduché alelové diskriminační testy založené na sondě nebo metody analýzy křivky tání s vysokým rozlišením. . Vygenerovaná data budou uložena lokálně ve stálých úložištích dat JIPMER a AIIMS a budou také sdílena s ženevskou platformou pro výzkum pediatrické onko-hematologie. S řídícím výborem Clinical Pharmacogenomics Implementation Consortium® (CPIC) bude podepsána dohoda o použití farmakogenetických dat získaných v této studii k posouzení, které genetické testy by byly vhodnější pro indickou populaci pacientů, což umožní vývoj panelů specifických pro populaci. napříště

Měření hladin léku v plazmě nebo celé krvi/červených krvinkách (Volitelné):

Analytická data získaná z rutinního terapeutického monitorování léků budou rovněž shromažďována a analyzována ve vztahu ke genetickým variantám a klinickým výsledkům. Vzorky plazmy nebo vzorky plné krve budou rutinně odebírány během indukce a udržování pro monitorování hladin a aktivity léčiva pomocí analytických metod založených na ELISA nebo LC-MS/MS. To nám také umožní vyhodnotit genetické predispozice nezávisle na hladinách léků. Úroveň aktivity L-asparaginázy bude měřena (pomocí ELISA) z plazmy odebrané v den 3 po první infuzi. U 6-merkaptopurinu budou vzorky plné krve odebírány během osmi týdnů udržovací terapie (tj. mezi 49. a 56. dnem) a hladiny 6-merkaptopurinu, 6-thioguaninu a 6-methylmerkaptopurinu budou měřeny v červených krvinkách. Během indukční terapie methotrexátem budou vzorky plné krve odebírány 48 hodin po ukončení infuze. Během udržovací léčby methotrexátem budou během 7. týdne odebrány vzorky a provedeny analýzy jeho metabolitů. Pro vinkristin byly během indukce odebrány vzorky 24 hodin po ukončení infuze.

Analýza plazmatických proteinových markerů a úložiště biologického materiálu pro budoucí studie:

Tato část se neplánuje v rámci aktuální žádosti o grant na výzkum, bude však provedeno vzorové bankovnictví. V budoucím samostatném projektu nebo jako pokračování současného výzkumného projektu bude test Proximity Extension Assay (PEA) vyvinutý společností Olink Proteomics AB (se sídlem v Uppsalské univerzitě, Švédsko) použit k současné kvantifikaci 184 onkologie, buněčného růstu a imunologie. -příbuzné biomarkery lidských proteinů (vybrány na základě informací od odborníků v oboru a jejich rolí v patofyziologii). Tento test vyžaduje vzorek menší než 10 µl plazmy nebo krve a může měřit panel 92 proteinových biomarkerů a tři vzorky vnitřní kontroly najednou. Tento test bude proveden s použitím 96-jamkové destičky pro každý panel, vybraný samostatně, a nevyžaduje žádné promývací kroky. Schopnost multimarkerového skóre přesně předpovídat výsledky bude detekována pomocí křivek provozních charakteristik přijímače (ROC) spolu s analýzami citlivosti a specificity.