Farmakogenomisk foreningsundersøgelse i indiske børn med akut lymfoblastisk leukæmi (MPGx-INDALL)

Primære mål:

1. At studere sammenhænge mellem statiske kimlinjevarianter med tidlig kemoterapi-relaterede toksiciteter (behandlingsrelaterede toksiciteter) hos børn med ALL, der gennemgår Icicle-behandlingsprotokollen.
2. At undersøge de somatiske og kimlinjegenetiske markører forbundet med henholdsvis effektiviteten og toksiciteten af ​​glukokortikoid respons.
3. At biobanke biologiske prøver og kliniske data til fremtidige associationsanalyser med henblik på at udvikle biomarkører for behandlingsprotokollens effektivitet og toksicitet.

Sekundære mål:

1. At studere virkningen af ​​forekomsten af ​​tidlige toksiciteter på livskvaliteten under aktiv ALL-behandling (fysisk og følelsesmæssig livskvalitet ved hjælp af PedsQL-værktøjet).
2. At evaluere genetiske associationer (somatisk og kimlinje) med samlet overlevelse, ikke-tilbagefaldsdødelighed, tilbagefaldsfri overlevelse og begivenhedsfri overlevelse.

Kliniske resultater:

Alle data vil blive registreret direkte i en elektronisk Case Report Form (CRF) eller på indledende papirbaserede formularer af centrets kliniske forskningsassistent eller dataansvarlig med hjælp fra forskningssygeplejerske og seniorforsker ansat i projektet. Hvert centers kliniske investigator vil kontrollere, datere og underskrive formularerne elektronisk med planlagt inter-center og tredjeparts dataovervågning. Alle patientdata vil blive gemt under et pseudonym. Kliniske data, der er relevante for undersøgelsens mål, vil blive delt (f.eks. demografi, sygdomsklassificering, test af minimal residual sygdom (MRD), cytogenetik, opfølgningsdetaljer, toksicitetsdata, overlevelsesdata, tilbagefaldsdata, leverfunktionstests, tidlig behandlingsrelateret toksicitet). Dette vil også inkludere enhver lægemiddelrelateret toksicitet ≥ grad 3, der forekommer fra den første induktionsdag indtil midten af ​​vedligeholdelsesbehandlingen.

TRT'er under vedligeholdelsesbehandling er hovedsageligt hæmatologiske og hepatiske toksiciteter, der forekommer inden for de første 100 dage efter påbegyndelse af vedligeholdelses- eller fortsættelsesbehandling, og hvad der indtræffer først, vil blive brugt til incidensanalyse. Toksiciteter vil blive klassificeret ved hjælp af Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE-version 5.0 - https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm#ctc_50. Flere hændelser for den samme patient vil også blive registreret til analyse. Data om MRD, sygdomsrespons efter en uge (profase) og sygdomsrespons ved afslutning af steroidbehandling vil blive vurderet i forhold til somatiske genetiske varianter.

Andre kliniske resultater, der skal vurderes i forhold til genetiske markører, er forekomsten af ​​tilbagefald af sygdom (dvs. varigheden mellem dagen for fuldstændig remission og dagen for forekomsten af ​​tilbagefald), ikke-tilbagefaldsdødelighed (død som følge af enhver anden årsag end en tilbagefald af sygdommen) og overordnet overlevelse (OS). Der vil være minimum et års opfølgning (dog vil alle patienter fortsat blive fulgt og vil blive analyseret igen 5 år efter behandling for overlevelsesresultater) for at evaluere resultater såsom OS og RFS. EFS er defineret som tiden fra behandlingsstart til den første induktionssvigt, manglende respons eller progression af sygdommen, død af enhver årsag, eller er censureret på datoen for sidste opfølgning. OS defineres som tiden fra behandlingsstart til død uanset årsag. Patienter fra Jawaharlal Institute of Post-graduate Medical Education and Research (JIPMER) og All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) vil svare på et livskvalitetsspørgeskema på diagnosetidspunktet og omkring dag 100 (+/-30 dage) af vedligeholdelsesfasen (andre tidspunkter under vedligeholdelsesterapi vil blive evalueret, men ikke under det nuværende forskningsforslags rammer) ved brug af de generiske kerneskalaer i den pædiatriske livskvalitetsopgørelse, PedsQL (https://www.pedsql.org) /). Kræftmodulet i pedSQl-spørgeskemaet vil blive implementeret, hvis det er klar på tidspunktet for rekrutteringen af ​​den første patient i henhold til retningslinjerne fra Mapi Research Trust, som leverer disse spørgeskemaer ved opnåelse af licens (https://eprovide.mapi-trust.org /). Ellers vil generisk modul blive implementeret. Andre data, såsom socioøkonomiske og ernæringsmæssige statusdata vil blive indsamlet (Uploadet på webportalen sammen med "CRF"), og ernæringsanbefalingerne implementeret som en del af den rutinemæssige standardbehandlingsprotokol vil blive udtrukket og brugt på tidspunktet for analysere, om de har en indvirkning som konfounder på nogen af ​​de undersøgte resultater

Prøveudtagningsprocedure:

Spytprøver på rekrutteringstidspunktet, fuldblodsprøve (3-5 ml) opsamles ved fuldstændig remission, opsamlet i EDTA-rør vil blive holdt frosset ved -80°C indtil ekstraktion. Knoglemarvsprøver vil også blive opsamlet i EDTA-rør og opbevaret frosset ved -80°C indtil ekstraktion, ligesom prøver tilovers efter MRD-testning. Plasmaprøver vil også blive opsamlet i EDTA blodopsamlingsrør, og plasmaseparation vil blive udført (4 ml fuldblodsprøve) ved hjælp af en svingende spandcentrifuge, der roterer i 10 minutter med en hastighed på 1300 g relativ centrifugalkraft. Alikvoter på 250 µL plasma vil blive opbevaret ved -80°C i præ-mærkede kryorør.

DNA-ekstraktion vil blive udført i batches, og en aliquot vil blive delt med Genève-teamet til sekventeringsanalyser. DNA-koncentrationer vil blive bestemt ved hjælp af Qubit eller en anden SYBR Green-baseret metode, og integritet vil blive målt ved hjælp af Tapestation, hvor GQN-værdier større end 7,5 anvendes til de genetiske analyser. Oprensnings- og kvantificeringsprocesser er allerede etableret på både JIPMER- og AIIMS-centrene. Resterende aliquoter vil blive opbevaret i deres respektive biobanker. Ingen håndskrevne etiketter accepteres; alle etiketter vil blive behørigt udskrevet med et anonymiseret patient-id, prøvetype og tidspunkt for afhentning. Hvert center vil sikre prøveanonymisering, før prøverne udsendes til delte analyser. To alikvoter, hver med ca. 1,0 µg DNA i 50 µl 10 mM Tris (8,0), vil blive brugt til sekventering (kimlinje 70X, somatisk 150X) i fase 1-analyse i Genève og til real-time PCR-genotyping eller open array genotyping i fase 2-analyse i Indien. Andre alikvoter vil blive opbevaret i biobanker på respektive centre til fremtidige undersøgelser.

Fase 1 genetisk variantanalyse ved hjælp af Whole-exome sekventering:

Hel-eksom-sekventering vil blive udført på Campus Biotechs Genomics Platform ved Universitetet i Genève Ved at bruge 100 kimlinje-DNA-prøver og 100 DNA-prøver fra leukæmiceller (samme patienter), vil hel-eksom-sekventering bruge følgende arbejdsgang i henhold til producentens protokoller: ( i) biblioteksforberedelse; (ii) sekventering under anvendelse af et HiSeq4000-system med en gennemsnitlig dækning på 70X for kimlinje-DNA-prøver og 150X for somatiske DNA-prøver (Illumina); (iii) rådataintegration og -lagring i Laboratory Information Management System (LIMS) på Pediatric Onco-Hematology Research Platform ved Genèves universitets afdeling for pædiatri, gynækologi og obstetrik. Data vil blive delt med det schweiziske institut for bioinformatik via LIMS for ekstra input til analysen (analyser vil hovedsageligt blive udført af en postdoc-stipendiat) og med JIPMER og AIIMS til fremtidige undersøgelser.

Genetisk dataanalyse:

Til genetisk dataanalyse vil hele genomer blive justeret med hg19-referencegenomet ved hjælp af en Burrows-Wheeler-aligner, PCR-duplikater vil blive fjernet ved hjælp af PICARD-værktøjer, og basiskvalitetsscore-rekalibreringer vil blive udført ved hjælp af Genome Analysis Toolkit (GATK). Rensede BAM-filer vil blive brugt til at oprette pile-up-filer ved hjælp af SAM-værktøjet. Germline-varianter vil blive kaldt ved hjælp af en GATK Haplotype Caller, og variantkvalitetsresultater vil blive rekalibreret baseret på offentlige datasæt ved hjælp af Variant Recalibrate-værktøjet og kommenteret ved hjælp af ANNOVAR. Ikke-leukæmiske varianter vil derefter blot blive trukket fra leukæmivarianter for at opnå en leukæmispecifik variantliste. Leukæmiske og ikke-leukæmiske sekvenser vil også blive analyseret samtidigt for at påvise mutationer ved hjælp af de heuristiske metoder, der er tilgængelige i Varscan- og Mu Tect-værktøjerne. Varianter, der kan opstå på grund af sekvensfejl, vil blive detekteret af SAVI-algoritmen. Vi vil udføre analyse via (i) en kandidatgentilgang med filtrerede varianter/mutationer til de udvalgte gener baseret på en hypotese, og (ii) hypotesefri, eksomdækkende associationsanalyse, hvis fokus vil være på varianterne lokaliseret i eksoniske områder, missense- eller nonsensvarianter med forudsagt funktionel effekt, samt variationer i splejsningssteder. De forudsagte effekter af missense-varianter på proteinfunktion vil blive vurderet i silico ved hjælp af SIFT og PolyPhen2 indarbejdet i VEP-værktøjer. Variantfiltrering vil blive udført baseret på 1000 Genomes og NHLBI GO Exome Sequencing-projekterne. Fishers eksakte test (allelisk association) og Cochran-Armitage-testen for trends vil blive implementeret i PLINK for at søge efter sammenhænge mellem kliniske resultater og genetiske varianter.

Associationsanalyse for kvantitative og binære data vil blive analyseret ved hjælp af generelle lineariserede modeller i PLINK, med en signifikansgrænse på 0,05 pr. antal varianter for kandidat- og exom-dækkende tilgange. Alternative analyser med en p-værdi på 0,05 vil blive opsat, og justeringer for multiple tests vil blive udført ved hjælp af Benjamin-Hochbergs falske opdagelsesrate: varianter anses for at være signifikant associerede, hvis de har en falsk opdagelsesrate lavere end 5 % ( for EWAS) eller 10 % (til kandidatgenanalyse).

Genvalg af kandidat:

De farmakogenetiske varianter antages at påvirke kinetikken og dynamikken af ​​kemoterapeutiske lægemidler i behandlingsprotokollen (hovedsageligt hentet fra PharmGKB). Andre farmakogener, som kan have en indvirkning på de fysiologiske funktioner, der bidrager til patofysiologien af ​​toksiciteter, vil også blive inkluderet. Mindre allelfrekvens over 15 %, funktionalitet som et kriterium for variantfiltrering til analyse vil blive implementeret. En liste over potentielle kandidater findes i bilaget "Germline_Genes.txt".

Kandidat-gen-selektion til somatisk varianttestning: Et sæt kandidatgener blev kompileret efter en omfattende litteraturgennemgang. Disse gener blev udvalgt, fordi de: i) blev rapporteret af individuelle associationsstudier; ii) deltage i de farmakodynamiske veje for steroidterapier og andre kemoterapeutiske midler; iii) er nøgleaktører i sygdomspatogenese eller de immunologiske veje til sygdomsbekæmpelse; iv) deltage i reparationen af ​​skader forårsaget af kemoterapi og stråling; v) var op- eller nedreguleret i lymfoblastoide celler følsomme eller resistente over for prednisolon i eksperimenterne udført i vores samarbejdspartner og mentor Prof. Maja Krajinovics laboratorium; vi) kan opnås via Ingenuity Pathway Analysis®, der er specifik for steroider, kemoterapi og andre støttende behandlingsterapier. Kun varianter af disse gener vil blive fodret ind i den statistiske analyse for at finde associationer. Unikke befolkningsdatasæt fra britisk biobank (undergruppe af indisk befolkning) vil også blive brugt til specifik fænotype for at udvælge nogle af kandidaterne. For somatiske varianter vil offentlige datalagre såsom DepMap og TARGET data blive overvejet. Sættet af kandidatgener vil således muliggøre oprettelsen af ​​en leukæmi-sekventeringsdatabase for en enkelt etnicitet sammen med dens kliniske og opfølgende data, alt opnået fra et enkelt studie. Dette vil tjene som en værdifuld ressource for forskere, der undersøger spørgsmål relateret til ALL behandling hos børn.

De somatiske kandidat- og kimlinievarianter påvist ved hel exome-sekventering vil blive valideret ved hjælp af direkte Sanger-sekventering efter PCR-amplifikation. Når den er til stede i en større klonal population, muliggør Sanger-sekventering påvisning af mutationer i heterozygote tilstande. Derfor vil mutationer rapporteret i < 25 % af aflæsningerne ikke blive inkluderet i denne valideringsfase.

Fase 2 genotyping for udvalgte kandidater fra fase 1 analysen:

Fase 2-analyser vil omfatte screening af 400 kimlinje-DNA-prøver fra de 120 bedste kandidater identificeret i fase1's kimlinje-sekventeringsassocieringsanalyse med TRT. Somatisk DNA-analyse omfatter screening af 150 prøver fra de 100 bedste kandidater fra fase 1-analyse. En open-array-metodologi (ThermoScientific) eller specialfremstillede mikroarrays (Axiom) kunne bruges som en omkostningseffektiv strategi. Vi planlægger at udvikle en omkostningseffektiv screeningsmetodologi, der er nem at implementere til rutinemæssig overvågning af de varianter, der er mest forbundet med de undersøgte kliniske resultater, f.eks. allelspecifik PCR eller simple probebaserede alleldiskriminationsassays eller højopløselige smeltekurveanalysemetoder . Data genereret vil blive lagret lokalt i JIPMER og AIIMS' permanente datalagre og vil også blive delt med Geneves Pediatric Onco-Hematology Research Platform. Der vil blive underskrevet en aftale med Clinical Pharmacogenomics Implementation Consortium®(CPIC)-styregruppen om brug af de farmakogenetiske data, der er genereret i denne undersøgelse til at vurdere, hvilke genetiske tests, der ville være mere passende for den indiske patientpopulation, og dermed muliggøre udviklingen af ​​populationsspecifikke paneler i fremtiden

Måling af lægemiddelniveauer i plasma eller fuldblod/røde blodlegemer (valgfrit):

De analytiske data opnået fra rutinemæssige terapeutiske lægemiddelovervågningstjenester vil også blive indsamlet og analyseret i forhold til genetiske varianter og kliniske resultater. Plasmaprøver eller fuldblodsprøver vil rutinemæssigt blive indsamlet under induktion og vedligeholdelse for at overvåge lægemiddelniveauer og aktivitet ved hjælp af ELISA eller LC-MS/MS-baserede analysemetoder. Dette vil også give os mulighed for at evaluere genetiske dispositioner uafhængigt af lægemiddelniveauer. Aktivitetsniveauet af L-asparaginase vil blive målt (ved hjælp af ELISA) fra plasma opsamlet på dag 3 efter den første infusion. For 6-mercaptopurin vil der blive indsamlet fuldblodsprøver i løbet af de otte ugers vedligeholdelsesbehandling (dvs. mellem dag 49 og 56), og 6-mercaptopurin-, 6-thioguanin- og 6-methylmercaptopurin-niveauer vil blive målt i røde blodlegemer. Under induktionsbehandling med methotrexat vil der blive taget fuldblodsprøver 48 timer efter afslutningen af ​​infusionen. Under vedligeholdelsesbehandling med methotrexat vil der blive indsamlet prøver i uge 7, og dets metabolitter analyseres. For vincristin under induktion blev prøver udtaget 24 timer efter afslutningen af ​​infusionen.

Plasmaprotein-markøranalyse og biologisk materialedepot til fremtidige undersøgelser:

Denne del er ikke planlagt til at finde sted under den aktuelle forskningsbevillingsansøgning, dog vil der blive udført prøvebanking. I et fremtidigt separat projekt eller som fortsættelse af det nuværende forskningsprojekt, vil Proximity Extension Assay (PEA) udviklet af Olink Proteomics AB (udvundet af Uppsala Universitet, Sverige) blive brugt til samtidig at kvantificere 184 onkologi, cellevækst og immunologi -relaterede humane proteinbiomarkører (skal vælges baseret på input fra eksperter på området og deres roller i patofysiologien). Denne analyse kræver en prøve på mindre end 10 µL plasma eller blod og kan måle et panel af 92 proteinbiomarkører og tre interne kontrolprøver på én gang. Denne analyse vil blive udført ved hjælp af en 96-brønds plade for hvert panel, valgt separat, og det kræver ingen vasketrin. Multimarkør-scorens evne til præcist at forudsige resultater vil blive detekteret ved hjælp af receiver operation characteristic (ROC) kurver sammen med sensitivitets- og specificitetsanalyser.