Étude d'association pharmacogénomique chez des enfants indiens atteints de leucémie aiguë lymphoblastique (MPGx-INDALL)

Objectifs principaux:

1. Étudier les associations de variants germinaux statiques avec les toxicités précoces liées à la chimiothérapie (toxicités liées au traitement) chez les enfants atteints de LAL subissant le protocole de traitement Icicle.
2. Étudier les marqueurs génétiques somatiques et germinaux associés respectivement à l'efficacité et à la toxicité de la réponse aux glucocorticoïdes.
3. Biobanquer des échantillons biologiques et des données cliniques pour de futures analyses d'association afin de développer des biomarqueurs de l'efficacité et de la toxicité du protocole de traitement.

Objectifs secondaires :

1. Étudier l'impact de la survenue de toxicités précoces sur la qualité de vie lors d'un traitement actif de LAL (qualité de vie physique et émotionnelle à l'aide de l'outil PedsQL).
2. Évaluer les associations génétiques (somatiques et germinales) avec la survie globale, la mortalité sans rechute, la survie sans rechute et la survie sans événement.

Résultats cliniques:

Toutes les données seront enregistrées directement dans un formulaire de rapport de cas électronique (CRF) ou sur des formulaires papier initiaux par l'assistant de recherche clinique ou le gestionnaire de données du centre avec l'aide d'une infirmière de recherche et d'un chercheur principal employés dans le cadre du projet. L'investigateur clinique de chaque centre vérifiera, datera et signera les formulaires par voie électronique, avec une surveillance planifiée des données inter-centres et tierces parties. Toutes les données des patients seront enregistrées sous un pseudonyme. Les données cliniques pertinentes aux objectifs de l'étude seront partagées (p. toxicités). Cela inclura également toute toxicité liée au médicament ≥ grade 3 survenant du premier jour d'induction jusqu'au milieu du traitement d'entretien.

Les TRT pendant le traitement d'entretien sont principalement des toxicités hématologiques et hépatiques survenant dans les 100 premiers jours suivant le début du traitement d'entretien ou de continuation, et la première éventualité sera utilisée pour l'analyse de l'incidence. Les toxicités seront classées à l'aide des Critères de terminologie communs pour les événements indésirables (CTCAE-version 5.0 - https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm#ctc_50. Plusieurs événements pour le même patient seront également enregistrés pour analyse. Les données sur la MRD, la réponse de la maladie à une semaine (prophase) et la réponse de la maladie à la fin de la corticothérapie seront évaluées par rapport aux variantes génétiques somatiques.

Les autres résultats cliniques à évaluer en relation avec les marqueurs génétiques sont l'incidence de la rechute de la maladie (c'est-à-dire la durée entre le jour de la rémission complète et le jour de l'apparition de la rechute), la mortalité sans rechute (décès dû à toute cause autre qu'une rechute de la maladie) et la survie globale (SG). Il y aura un minimum d'un an de suivi (Cependant, tous les patients continueront à être suivis et seront à nouveau analysés 5 ans après le traitement pour les résultats de survie) pour évaluer les résultats tels que la SG et la RFS. L'EFS est définie comme le temps écoulé entre le début du traitement et le premier échec d'induction, la non-réponse ou la progression de la maladie, le décès quelle qu'en soit la cause, ou est censurée à la date du dernier suivi. La SG est définie comme le temps écoulé entre le début du traitement et le décès, quelle qu'en soit la cause. Les patients du Jawaharlal Institute of Post-graduate Medical Education and Research (JIPMER) et du All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) répondront à un questionnaire de qualité de vie au moment du diagnostic et vers le jour 100 (+/-30 jours) de la phase d'entretien (d'autres moments pendant le traitement d'entretien seraient évalués mais pas dans le cadre de la proposition de recherche actuelle), en utilisant les échelles de base génériques de l'inventaire pédiatrique de la qualité de vie, PedsQL (https://www.pedsql.org /). Le module Cancer du questionnaire pedSQl sera mis en œuvre s'il est prêt au moment du recrutement du premier patient conformément aux directives de Mapi Research Trust qui fournit ces questionnaires lors de l'obtention de la licence (https://eprovide.mapi-trust.org /). Sinon, le module générique sera implémenté. D'autres données, telles que les données sur l'état socio-économique et nutritionnel seront collectées (téléchargées sur le portail Web avec le « CRF »), et les recommandations nutritionnelles mises en œuvre dans le cadre du protocole de traitement standard de routine seront extraites et utilisées au moment de analyse s'ils ont un impact en tant que facteurs de confusion sur l'un des résultats à l'étude

Procédure d'échantillonnage:

Échantillons de salive au moment du recrutement, un échantillon de sang total (3-5 ml) est prélevé à rémission complète, recueilli dans des tubes EDTA et conservé congelé à -80 ° C jusqu'à l'extraction. Des échantillons de moelle osseuse seront également prélevés dans des tubes EDTA et conservés congelés à -80 °C jusqu'à l'extraction, tout comme les échantillons restants après les tests MRD. Des échantillons de plasma seront également prélevés dans des tubes de prélèvement sanguin EDTA, et une séparation du plasma sera effectuée (échantillon de sang total de 4 ml) à l'aide d'une centrifugeuse à godet oscillant tournant pendant 10 minutes à une vitesse de 1300 g de force centrifuge relative. Des aliquotes de 250 µL de plasma seront conservées à -80°C dans des cryotubes pré-étiquetés.

L'extraction d'ADN sera effectuée par lots, et un aliquot sera partagé avec l'équipe genevoise pour les analyses de séquençage. Les concentrations d'ADN seront déterminées à l'aide de Qubit ou d'une autre méthode basée sur SYBR Green, et l'intégrité sera mesurée à l'aide de Tapestation, des valeurs GQN supérieures à 7,5 étant utilisées pour les analyses génétiques. Des processus de purification et de quantification ont déjà été mis en place dans les centres JIPMER et AIIMS. Les aliquotes restantes seront stockées dans leurs biobanques respectives. Aucune étiquette manuscrite ne sera acceptée ; toutes les étiquettes seront dûment imprimées avec un identifiant de patient anonymisé, le type d'échantillon et l'heure de la collecte. Chaque centre assurera l'anonymisation des échantillons avant d'envoyer les échantillons pour des analyses partagées. Deux aliquotes, chacune avec environ 1,0 µg d'ADN dans 50 µl 10 mM de Tris (8,0), seront utilisées pour le séquençage (germline 70X, somatique 150X) dans l'analyse de phase 1 à Genève et pour le génotypage PCR en temps réel ou le génotypage en réseau ouvert en analyse de phase 2 en Inde. D'autres aliquotes seraient stockées dans des biobanques des centres respectifs pour de futures investigations.

Analyse de variantes génétiques de phase 1 à l'aide du séquençage de l'exome entier :

Le séquençage de l'exome entier sera effectué à la plateforme de génomique de Campus Biotech à l'Université de Genève. À l'aide de 100 échantillons d'ADN germinal et de 100 échantillons d'ADN de cellules leucémiques (mêmes patients), le séquençage de l'exome entier utilisera le flux de travail suivant selon les protocoles des fabricants : ( i) préparation de la bibliothèque ; (ii) séquençage à l'aide d'un système HiSeq4000 avec une couverture moyenne de 70X pour les échantillons d'ADN germinal et de 150X pour les échantillons d'ADN somatique (Illumina); (iii) intégration et stockage des données brutes dans le système de gestion de l'information du laboratoire (LIMS) de la Plateforme de recherche en onco-hématologie pédiatrique du Département de pédiatrie, gynécologie et obstétrique de l'Université de Genève. Les données seront partagées avec l'Institut suisse de bioinformatique via le LIMS, pour une contribution supplémentaire à l'analyse (les analyses seront principalement effectuées par un boursier postdoctoral), et avec le JIPMER et l'AIIMS pour de futures investigations.

Analyse des données génétiques :

Pour l'analyse des données génétiques, les génomes entiers seront alignés avec le génome de référence hg19 à l'aide d'un aligneur Burrows-Wheeler, les doublons de PCR seront supprimés à l'aide des outils PICARD et des recalibrages de la qualité de base seront effectués à l'aide de la boîte à outils d'analyse du génome (GATK). Les fichiers BAM nettoyés seront utilisés pour créer des fichiers d'empilement à l'aide de l'outil SAM. Les variantes de la lignée germinale seront appelées à l'aide d'un appelant d'haplotype GATK, et les scores de qualité des variantes seront recalibrés sur la base d'ensembles de données publics à l'aide de l'outil de recalibrage des variantes et annotés à l'aide d'ANNOVAR. Les variants non leucémiques seront alors simplement soustraits des variants leucémiques pour obtenir une liste de variants spécifiques leucémiques. Les séquences leucémiques et non leucémiques seront également analysées simultanément pour détecter les mutations en utilisant les méthodes heuristiques disponibles dans les outils Varscan et Mu Tect. Les variantes qui pourraient survenir en raison d'erreurs de séquence seront détectées par l'algorithme SAVI. Nous effectuerons une analyse via (i) une approche de gène candidat avec des variantes/mutations filtrées des gènes sélectionnés sur la base d'une hypothèse, et (ii) une analyse d'association sans hypothèse, à l'échelle de l'exome, dont l'accent sera mis sur les variantes situés dans des régions exoniques, des variantes faux-sens ou non-sens avec effet fonctionnel prédit, ainsi que des variations dans les sites d'épissage. Les effets prédits des variants faux-sens sur la fonction des protéines seront évalués in silico à l'aide de SIFT et de PolyPhen2 intégrés aux outils VEP. Le filtrage des variantes sera effectué sur la base des projets 1000 Genomes et NHLBI GO Exome Sequencing. Le test exact de Fisher (association allélique) et le test de Cochran-Armitage pour les tendances seront mis en œuvre dans PLINK pour rechercher des associations entre les résultats cliniques et les variants génétiques.

L'analyse d'association pour les données quantitatives et binaires sera analysée à l'aide de modèles linéarisés généraux dans PLINK, avec un seuil de signification de 0,05 par nombre de variantes pour les approches candidate et à l'échelle de l'exome. Des analyses alternatives avec une p-value de 0,05 seront mises en place, et des ajustements pour les tests multiples seront effectués en utilisant la méthode du taux de fausses découvertes de Benjamin-Hochberg : les variants sont considérés comme significativement associés s'ils ont un taux de fausses découvertes inférieur à 5 % ( pour EWAS) ou 10 % (pour l'analyse des gènes candidats).

Sélection du gène candidat :

Les variants pharmacogénétiques sont supposés affecter la cinétique et la dynamique des médicaments chimiothérapeutiques dans le protocole de traitement (principalement obtenus auprès de PharmGKB). D'autres pharmacogènes qui pourraient avoir un impact sur les fonctions physiologiques contribuant à la physiopathologie des toxicités seraient également inclus. Une fréquence d'allèles mineurs supérieure à 15 %, une fonctionnalité en tant que critère de filtrage des variantes pour l'analyse serait mise en œuvre. Une liste de candidats potentiels est donnée en annexe "Germline_Genes.txt".

Sélection de gènes candidats pour les tests de variantes somatiques : un ensemble de gènes candidats a été compilé à la suite d'une analyse documentaire approfondie. Ces gènes ont été sélectionnés parce qu'ils : i) ont été rapportés par des études d'association individuelles ; ii) participer aux voies pharmacodynamiques des thérapies stéroïdiennes et d'autres agents chimiothérapeutiques ; iii) sont des acteurs clés de la pathogenèse des maladies ou des voies immunologiques de contrôle des maladies ; iv) participer à la réparation des dommages causés par la chimiothérapie et la radiothérapie ; v) ont été régulés à la hausse ou à la baisse dans les cellules lymphoblastoïdes sensibles ou résistantes à la prednisolone dans les expériences réalisées dans le laboratoire de notre collaborateur et mentor, le professeur Maja Krajinovic ; vi) peut être obtenu via Ingenuity Pathway Analysis® spécifique aux stéroïdes, à la chimiothérapie et à d'autres thérapies de soins de soutien. Seules les variantes de ces gènes seront introduites dans l'analyse statistique pour trouver des associations. Des ensembles de données démographiques uniques de la biobanque britannique (sous-ensemble de la population indienne) seront également utilisés pour un phénotype spécifique afin de sélectionner certains des candidats. Pour les variantes somatiques, des référentiels de données publics tels que les données DepMap et TARGET seraient envisagés. L'ensemble des gènes candidats permettra ainsi la création d'une base de données de séquençage de la leucémie d'une seule ethnie, ainsi que ses données cliniques et de suivi, toutes issues d'une seule étude. Cela constituera une ressource précieuse pour les chercheurs qui enquêtent sur des questions liées au traitement de la LAL chez les enfants.

Les variants somatiques et germinaux candidats détectés par séquençage de l'exome entier seront validés par séquençage direct de Sanger après amplification par PCR. Lorsqu'il est présent dans une population clonale majeure, le séquençage Sanger permet la détection de mutations dans les états hétérozygotes. Par conséquent, les mutations signalées dans < 25 % des lectures ne seront pas incluses dans cette phase de validation.

Génotypage de phase 2 pour les candidats sélectionnés à partir de l'analyse de phase 1 :

Les analyses de la phase 2 comprendront le criblage de 400 échantillons d'ADN de lignée germinale parmi les 120 meilleurs candidats identifiés dans l'analyse d'association de séquençage de la lignée germinale de la phase 1 avec TRT. L'analyse de l'ADN somatique comprend le criblage de 150 échantillons parmi les 100 meilleurs candidats de l'analyse de phase 1. Une méthodologie à matrice ouverte (ThermoScientific) ou des puces à ADN sur mesure (Axiom) pourraient être utilisées comme stratégie rentable. Nous prévoyons de développer une méthodologie de dépistage rentable et facile à mettre en œuvre pour la surveillance de routine des variantes les plus associées aux résultats cliniques étudiés, par exemple, la PCR allèle-spécifique ou de simples tests de discrimination allélique basés sur des sondes ou des méthodes d'analyse de courbe de fusion à haute résolution. . Les données générées seront stockées localement dans les référentiels de données permanents de JIPMER et AIIMS et seront également partagées avec la Plateforme de recherche en onco-hématologie pédiatrique de Genève. Un accord sera signé avec le comité directeur du Clinical Pharmacogenomics Implementation Consortium® (CPIC) sur l'utilisation des données pharmacogénétiques générées dans cette étude pour évaluer quels tests génétiques seraient les plus appropriés pour la population de patients indiens, permettant ainsi le développement de panels spécifiques à la population. dans le futur

Mesure des taux de médicament dans le plasma ou le sang total/les globules rouges (facultatif) :

Les données analytiques obtenues à partir des services de surveillance thérapeutique de routine des médicaments seront également collectées et analysées en relation avec les variantes génétiques et les résultats cliniques. Des échantillons de plasma ou de sang total seront systématiquement prélevés pendant l'induction et la maintenance pour surveiller les niveaux et l'activité des médicaments à l'aide de méthodes analytiques basées sur ELISA ou LC-MS/MS. Cela nous permettra également d'évaluer les prédispositions génétiques indépendamment des niveaux de médicaments. Le niveau d'activité de la L-asparaginase sera mesuré (par ELISA) à partir de plasma prélevé au jour 3 après la première perfusion. Pour la 6-mercaptopurine, des échantillons de sang total seront prélevés au cours des huit semaines de traitement d'entretien (c'est-à-dire entre les jours 49 et 56), et les taux de 6-mercaptopurine, de 6-thioguanine et de 6-méthylmercaptopurine seront mesurés dans les globules rouges. Pendant le traitement d'induction au méthotrexate, des échantillons de sang total seront prélevés 48 heures après la fin de la perfusion. Pendant le traitement d'entretien au méthotrexate, des échantillons seront prélevés au cours de la semaine 7 et ses métabolites seront analysés. Pour la vincristine pendant l'induction, des échantillons ont été prélevés 24 heures après la fin de la perfusion.

Analyse des marqueurs protéiques plasmatiques et dépôt de matériel biologique pour de futures études :

Cette partie n'est pas prévue dans le cadre de la demande de subvention de recherche actuelle, cependant, une banque d'échantillons sera effectuée. Dans un futur projet séparé ou dans la continuité du projet de recherche actuel, le Proximity Extension Assay (PEA) développé par Olink Proteomics AB (issu de l'Université d'Uppsala, Suède) sera utilisé pour quantifier simultanément 184 oncologie, croissance cellulaire et immunologie biomarqueurs protéiques humains apparentés (à choisir en fonction de l'apport d'experts dans le domaine et de leurs rôles dans la physiopathologie). Ce test nécessite un échantillon de moins de 10 µL de plasma ou de sang et peut mesurer simultanément un panel de 92 biomarqueurs protéiques et trois échantillons de contrôle interne. Ce test sera effectué à l'aide d'une plaque de 96 puits pour chaque panneau, sélectionné séparément, et il ne nécessite aucune étape de lavage. La capacité du score multimarqueur à prédire avec précision les résultats sera détectée à l'aide de courbes de caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC), ainsi que d'analyses de sensibilité et de spécificité.