Farmacogenomische associatiestudie bij Indiase kinderen met acute lymfoblastische leukemie (MPGx-INDALL)

Primaire doelen:

1. Om de associaties van statische kiembaanvarianten met vroege chemotherapie-gerelateerde toxiciteiten (behandelingsgerelateerde toxiciteiten) te bestuderen bij kinderen met ALL die het Icicle-behandelingsprotocol ondergaan.
2. Om de somatische en kiemlijn genetische markers te onderzoeken die geassocieerd zijn met respectievelijk de werkzaamheid en toxiciteit van glucocorticoïde respons.
3. Om biologische monsters en klinische gegevens te biobanken voor toekomstige associatieanalyses om biomarkers te ontwikkelen voor de werkzaamheid en toxiciteit van het behandelingsprotocol.

Secundaire doelstellingen:

1. Het bestuderen van de impact van het optreden van vroege toxiciteiten op de kwaliteit van leven tijdens actieve ALL-behandeling (fysieke en emotionele kwaliteit van leven met behulp van de PedsQL-tool).
2. Evalueren van genetische associaties (somatisch en kiembaan) met algehele overleving, niet-terugvalmortaliteit, terugvalvrije overleving en gebeurtenisvrije overleving.

Klinische resultaten:

Alle gegevens worden direct geregistreerd in een elektronisch Case Report Form (CRF) of op initiële papieren formulieren door de klinische onderzoeksassistent of datamanager van het centrum met de hulp van onderzoeksverpleegkundige en senior onderzoeksmedewerker die binnen het project werkzaam zijn. De klinische onderzoeker van elk centrum controleert, dateert en ondertekent de formulieren elektronisch, met geplande gegevensbewaking tussen de centra en door derden. Alle patiëntgegevens worden onder een pseudoniem opgeslagen. Klinische gegevens die relevant zijn voor de doelstellingen van de studie zullen worden gedeeld (bijv. demografische gegevens, ziekteclassificatie, minimale residuele ziekte (MRD) testen, cytogenetica, follow-up details, toxiciteitsgegevens, overlevingsgegevens, terugvalgegevens, leverfunctietesten, vroege behandelingsgerelateerde toxiciteiten). Dit omvat ook elke geneesmiddelgerelateerde toxiciteit ≥ graad 3 die optreedt vanaf de eerste dag van inductie tot halverwege de onderhoudstherapie.

TRT's tijdens onderhoudstherapie zijn voornamelijk hematologische en hepatische toxiciteiten die optreden binnen de eerste 100 dagen na aanvang van de onderhoudsbehandeling of voortzetting van de behandeling, en welke zich het eerst voordoet, zal worden gebruikt voor incidentieanalyse. Toxiciteiten worden beoordeeld met behulp van de Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE-versie 5.0 - https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm#ctc_50. Meerdere gebeurtenissen voor dezelfde patiënt worden ook geregistreerd voor analyse. Gegevens over MRD, ziekterespons na één week (profase) en ziekterespons aan het einde van de behandeling met corticosteroïden zullen worden beoordeeld in relatie tot somatisch genetische varianten.

Andere klinische uitkomsten die met betrekking tot genetische markers moeten worden beoordeeld, zijn de incidentie van terugval van de ziekte (d.w.z. de duur tussen de dag van volledige remissie en de dag waarop de terugval optreedt), sterfte zonder terugval (overlijden door een andere oorzaak dan een terugval van de ziekte) en algehele overleving (OS). Er zal een follow-up van minimaal een jaar zijn (alle patiënten worden echter verder gevolgd en zullen 5 jaar na de behandeling opnieuw worden geanalyseerd op overlevingsresultaten) om resultaten zoals OS en RFS te evalueren. EFS wordt gedefinieerd als de tijd vanaf het begin van de behandeling tot het eerste falen van de inductie, non-respons of progressie van de ziekte, overlijden door welke oorzaak dan ook, of wordt gecensureerd op de datum van de laatste follow-up. OS wordt gedefinieerd als de tijd vanaf het begin van de therapie tot het overlijden door welke oorzaak dan ook. Patiënten van Jawaharlal Institute of Post-graduate Medical Education and Research (JIPMER) en All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) zullen op het moment van diagnose en rond dag 100 (+/- 30 dagen) reageren op een vragenlijst over de kwaliteit van leven van de onderhoudsfase (andere tijdstippen tijdens de onderhoudstherapie zouden worden geëvalueerd, maar niet onder de reikwijdte van het huidige onderzoeksvoorstel), met behulp van de generieke kernschalen van de pediatrische levenskwaliteit-inventaris, PedsQL (https://www.pedsql.org /). De kankermodule van de pedSQl-vragenlijst zal worden geïmplementeerd als deze klaar is tegen de tijd dat de eerste patiënt wordt geworven volgens de richtlijnen van Mapi Research Trust, die deze vragenlijsten levert bij het verkrijgen van de licentie (https://eprovide.mapi-trust.org /). Anders wordt een generieke module geïmplementeerd. Andere gegevens, zoals sociaal-economische en voedingsstatusgegevens, zullen worden verzameld (geüpload op het webportaal samen met "CRF"), en de voedingsaanbevelingen die zijn geïmplementeerd als onderdeel van het routinematige standaardbehandelingsprotocol zullen worden geëxtraheerd en gebruikt op het moment van analyse als ze een impact hebben als confounders op een van de onderzochte uitkomsten

Bemonsteringsprocedure:

Speekselmonsters op het moment van werving, volbloedmonster (3-5 ml) wordt verzameld bij volledige remissie, verzameld in EDTA-buisjes en tot extractie ingevroren bij -80°C. Beenmergmonsters zullen ook worden verzameld in EDTA-buisjes en tot extractie bij -80°C worden ingevroren, evenals monsters die overblijven na MRD-testen. Plasmamonsters zullen ook worden verzameld in EDTA-bloedafnamebuizen en plasmascheiding zal worden uitgevoerd (volbloedmonster van 4 ml) met behulp van een swinging bucket-centrifuge die gedurende 10 minuten ronddraait met een snelheid van 1300 g relatieve centrifugale kracht. Aliquots van 250 µL plasma worden bewaard bij -80°C in vooraf gelabelde cryobuisjes.

DNA-extractie zal in batches worden uitgevoerd en een aliquot zal worden gedeeld met het team van Genève voor sequentiëringsanalyses. DNA-concentraties worden bepaald met behulp van Qubit of een andere op SYBR Green gebaseerde methode, en integriteit wordt gemeten met behulp van Tapestation, waarbij GQN-waarden groter dan 7,5 worden gebruikt voor de genetische analyses. Zuiverings- en kwantificeringsprocessen zijn al tot stand gebracht in zowel de JIPMER- als de AIIMS-centra. Resterende aliquots worden opgeslagen in hun respectieve biobanken. Handgeschreven etiketten worden niet geaccepteerd; alle labels worden naar behoren afgedrukt met een geanonimiseerde patiënt-ID, het type monster en het tijdstip van verzameling. Elk centrum zorgt ervoor dat de monsters worden geanonimiseerd voordat de monsters worden verzonden voor gedeelde analyses. Twee aliquots, elk met ongeveer 1,0 µg DNA in 50 µl 10 mM Tris (8.0), zullen worden gebruikt voor sequencing (kiemlijn 70X, somatisch 150X) in fase 1-analyse in Genève en voor real-time PCR-genotypering of open-array genotypering in fase 2-analyse in India. Andere aliquots zouden worden opgeslagen in biobanken in respectieve centra voor toekomstig onderzoek.

Fase 1 genetische variantanalyse met behulp van Whole-exome sequencing:

Whole-exome-sequencing zal worden uitgevoerd op het Genomics-platform van Campus Biotech aan de Universiteit van Genève. Met behulp van 100 kiemlijn-DNA-monsters en 100 DNA-monsters van leukemische cellen (dezelfde patiënten), zal whole-exome-sequencing de volgende workflow gebruiken volgens de protocollen van de fabrikant: ( i) bibliotheekvoorbereiding; (ii) sequentiebepaling met behulp van een HiSeq4000-systeem met een gemiddelde dekking van 70X voor kiembaan-DNA-monsters en 150X voor somatische DNA-monsters (Illumina); (iii) integratie en opslag van onbewerkte gegevens in het Laboratory Information Management System (LIMS) van het Pediatric Onco-Hematology Research Platform van de afdeling Kindergeneeskunde, Gynaecologie en Verloskunde van de Universiteit van Genève. Gegevens zullen worden gedeeld met het Swiss Institute of Bioinformatics via het LIMS, voor extra input in de analyse (analyses zullen voornamelijk worden uitgevoerd door een postdoctoraal onderzoeker), en met de JIPMER en AIIMS voor toekomstig onderzoek.

Genetische gegevensanalyse:

Voor de analyse van genetische gegevens zullen hele genomen worden uitgelijnd met het hg19-referentiegenoom met behulp van een Burrows-Wheeler-aligner, PCR-duplicaten zullen worden verwijderd met behulp van PICARD-tools en herkalibraties van de basiskwaliteitsscore zullen worden uitgevoerd met behulp van de Genome Analysis Toolkit (GATK). Opgeschoonde BAM-bestanden worden gebruikt om stapelbestanden te maken met behulp van de SAM-tool. Kiembaanvarianten worden aangeroepen met behulp van een GATK Haplotype Caller en de kwaliteitsscores van varianten worden opnieuw gekalibreerd op basis van openbare datasets met behulp van de Variant Recalibrate-tool en geannoteerd met behulp van ANNOVAR. Niet-leukemische varianten worden dan eenvoudigweg afgetrokken van leukemische varianten om een ​​lijst met leukemische specifieke varianten te verkrijgen. Leukemische en niet-leukemische sequenties zullen ook gelijktijdig worden geanalyseerd om mutaties te detecteren met behulp van de heuristische methoden die beschikbaar zijn in de Varscan- en Mu Tect-tools. Varianten die kunnen ontstaan ​​als gevolg van volgordefouten, worden gedetecteerd door het SAVI-algoritme. We zullen analyse uitvoeren via (i) een kandidaat-genbenadering met gefilterde varianten/mutaties van de geselecteerde genen op basis van een hypothese, en (ii) hypothese-vrije, exoom-brede associatie-analyse, waarbij de focus zal liggen op de varianten gelokaliseerd in exonische regio's, missense of nonsense varianten met voorspeld functioneel effect, evenals variaties in splitsingsplaatsen. De voorspelde effecten van missense-varianten op de eiwitfunctie zullen in silico worden beoordeeld met behulp van SIFT en PolyPhen2 opgenomen in VEP-tools. Variantfiltering zal worden uitgevoerd op basis van de 1000 Genomes- en de NHLBI GO Exome Sequencing-projecten. Fisher's exact-test (allelische associatie) en de Cochran-Armitage-test voor trends zullen in PLINK worden geïmplementeerd om te zoeken naar associaties tussen klinische uitkomsten en genetische varianten.

Associatie-analyse voor kwantitatieve en binaire gegevens zal worden geanalyseerd met behulp van algemene gelineariseerde modellen in PLINK, met een significantiedrempel van 0,05 per aantal varianten voor de kandidaat- en exome-brede benaderingen. Alternatieve analyses met een p-waarde van 0,05 zullen worden opgezet en aanpassingen voor meervoudige testen zullen worden uitgevoerd met behulp van de Benjamin-Hochberg methode voor valse ontdekking: varianten worden als significant geassocieerd beschouwd als ze een valse ontdekking hebben van minder dan 5% ( voor EWAS) of 10% (voor kandidaat-genanalyse).

Selectie van kandidaat-genen:

Er wordt verondersteld dat de farmacogenetische varianten de kinetiek en dynamiek van chemotherapeutische geneesmiddelen in het behandelingsprotocol beïnvloeden (voornamelijk verkregen van PharmGKB). Andere farmacogenen die van invloed kunnen zijn op de fysiologische functies die bijdragen aan de pathofysiologie van toxiciteiten, zouden ook worden opgenomen. Kleine allelfrequentie boven 15%, functionaliteit als criterium voor variantfiltering voor analyse zou worden geïmplementeerd. Een lijst van mogelijke kandidaten is te vinden in bijlage "Germline_Genes.txt".

Selectie van kandidaatgenen voor het testen van somatische varianten: Na een uitgebreid literatuuronderzoek is een set kandidaatgenen samengesteld. Deze genen werden geselecteerd omdat ze: i) werden gerapporteerd door individuele associatiestudies; ii) deelnemen aan de farmacodynamische routes van steroïdetherapieën en andere chemotherapeutische middelen; iii) sleutelactoren zijn in ziektepathogenese of de immunologische wegen van ziektebestrijding; iv) deelnemen aan het herstel van schade veroorzaakt door chemotherapie en bestraling; v) werden omhoog of omlaag gereguleerd in lymfoblastoïde cellen die gevoelig of resistent waren voor prednisolon in de experimenten die werden uitgevoerd in het laboratorium van onze medewerker en mentor prof. Maja Krajinovic; vi) kan worden verkregen via Ingenuity Pathway Analysis® specifiek voor steroïden, chemotherapie en andere ondersteunende zorgtherapieën. Alleen varianten van deze genen zullen worden ingevoerd in de statistische analyse om associaties te vinden. Unieke populatiedatasets van de Britse biobank (subset Indiase populatie) zullen ook worden gebruikt voor een specifiek fenotype om enkele van de kandidaten te selecteren. Voor somatische varianten kunnen openbare gegevensopslagplaatsen zoals DepMap en TARGET worden overwogen. De set kandidaatgenen zal dus de creatie mogelijk maken van een leukemie-sequencing-database van een enkele etniciteit, samen met de klinische en follow-upgegevens, allemaal verkregen uit een enkele studie. Dit zal dienen als een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers die vragen onderzoeken die verband houden met de behandeling van ALL bij kinderen.

De kandidaat-somatische en kiembaanvarianten gedetecteerd door volledige exome-sequencing zullen worden gevalideerd met behulp van directe Sanger-sequencing na PCR-amplificatie. Indien aanwezig in een grote klonale populatie, maakt Sanger-sequencing de detectie van mutaties in heterozygote toestanden mogelijk. Daarom worden mutaties gerapporteerd in <25% van de metingen niet opgenomen in deze validatiefase.

Fase 2 genotypering voor geselecteerde kandidaten uit de fase 1 analyse:

Fase 2-analyses omvatten het screenen van 400 kiembaan-DNA-monsters van de top 120 kandidaten die zijn geïdentificeerd in fase 1's kiembaansequencing-associatieanalyse met TRT. Somatische DNA-analyse omvat de screening van 150 monsters van de 100 beste kandidaten uit fase 1-analyse. Een open-array-methodologie (ThermoScientific) of op maat gemaakte microarrays (Axiom) kunnen worden gebruikt als een kosteneffectieve strategie. We zijn van plan een kosteneffectieve screeningsmethodologie te ontwikkelen die eenvoudig te implementeren is voor routinematige monitoring van de varianten die het meest geassocieerd zijn met de onderzochte klinische uitkomsten, bijv. . De gegenereerde gegevens worden lokaal opgeslagen in de permanente gegevensopslagplaatsen van JIPMER en AIIMS en worden ook gedeeld met het Pediatric Onco-Hematology Research Platform van Genève. Er zal een overeenkomst worden ondertekend met de stuurgroep van het Clinical Pharmacogenomics Implementation Consortium® (CPIC) over het gebruik van de farmacogenetische gegevens die in deze studie zijn gegenereerd om te beoordelen welke genetische tests geschikter zijn voor de Indiase patiëntenpopulatie, waardoor de ontwikkeling van populatiespecifieke panels mogelijk wordt. in de toekomst

Meting van medicijnniveaus in plasma of volbloed/rode bloedcellen (optioneel):

De analytische gegevens die worden verkregen van routinematige therapeutische drugsmonitoringdiensten zullen ook worden verzameld en geanalyseerd met betrekking tot genetische varianten en klinische resultaten. Plasmamonsters of volbloedmonsters zullen routinematig worden verzameld tijdens inductie en onderhoud voor het bewaken van geneesmiddelniveaus en -activiteit met behulp van op ELISA of LC-MS/MS gebaseerde analysemethoden. Dit zal ons ook in staat stellen om genetische predisposities te evalueren, onafhankelijk van medicijnniveaus. Het activiteitsniveau van L-asparaginase zal worden gemeten (met behulp van ELISA) van plasma dat op dag 3 na de eerste infusie is verzameld. Voor 6-mercaptopurine zullen volbloedmonsters worden verzameld tijdens de acht weken van onderhoudstherapie (d.w.z. tussen dag 49 en 56), en de niveaus van 6-mercaptopurine, 6-thioguanine en 6-methylmercaptopurine zullen worden gemeten in RBC's. Tijdens methotrexaat-inductietherapie worden 48 uur na het einde van de infusie volbloedmonsters genomen. Tijdens de onderhoudstherapie met methotrexaat worden in week 7 monsters verzameld en de metabolieten geanalyseerd. Voor vincristine tijdens inductie werden 24 uur na het einde van de infusie monsters verzameld.

Analyse van plasma-eiwitmarkers en opslag van biologisch materiaal voor toekomstige studies:

Dit onderdeel is niet gepland om plaats te vinden onder de huidige onderzoekssubsidieaanvraag, maar er zal wel een steekproefbank worden uitgevoerd. In een toekomstig afzonderlijk project of als voortzetting van het huidige onderzoeksproject, zal de Proximity Extension Assay (PEA), ontwikkeld door Olink Proteomics AB (afgesplitst van de Universiteit van Uppsala, Zweden), worden gebruikt om gelijktijdig 184 oncologie, celgroei en immunologie te kwantificeren. -gerelateerde menselijke eiwitbiomarkers (te kiezen op basis van de input van experts in het veld en hun rol in de pathofysiologie). Deze test vereist een monster van minder dan 10 µL plasma of bloed en kan een panel van 92 eiwitbiomarkers en drie interne controlemonsters tegelijk meten. Deze assay wordt uitgevoerd met behulp van een plaat met 96 putjes voor elk paneel, afzonderlijk geselecteerd, en vereist geen wasstappen. Het vermogen van de multi-markerscore om de resultaten nauwkeurig te voorspellen, wordt gedetecteerd met behulp van receiver operating Characteristic (ROC)-curven, samen met gevoeligheids- en specificiteitsanalyses.