Badanie stowarzyszenia farmakogenomicznego u indyjskich dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną (MPGx-INDALL)

Główne cele:

1. Zbadanie powiązań statycznych wariantów linii zarodkowej z wczesną toksycznością związaną z chemioterapią (toksycznością związaną z leczeniem) u dzieci z ALL poddawanych protokołowi leczenia Icicle.
2. Zbadanie markerów genetycznych somatycznych i germinalnych związanych odpowiednio ze skutecznością i toksycznością odpowiedzi glukokortykoidowej.
3. Do biobanku próbek biologicznych i danych klinicznych do przyszłych analiz asocjacyjnych w celu opracowania biomarkerów skuteczności i toksyczności protokołu leczenia.

Cele drugorzędne:

1. Zbadanie wpływu wystąpienia wczesnych toksyczności na jakość życia podczas aktywnego leczenia ALL (fizyczna i emocjonalna jakość życia za pomocą narzędzia PedsQL).
2. Ocena powiązań genetycznych (somatycznych i zarodkowych) z całkowitym przeżyciem, śmiertelnością bez nawrotów, przeżyciem bez nawrotów i przeżyciem bez zdarzeń.

Wyniki kliniczne:

Wszystkie dane zostaną zapisane bezpośrednio w elektronicznym formularzu opisu przypadku (CRF) lub na wstępnych formularzach w formie papierowej przez asystenta ds. badań klinicznych lub kierownika ds. danych z pomocą pielęgniarki badawczej i starszego pracownika naukowego zatrudnionych w ramach projektu. Badacz kliniczny każdego ośrodka sprawdzi, datuje i podpisze formularze elektronicznie, z planowanym monitorowaniem danych między ośrodkami i stron trzecich. Wszystkie dane pacjenta zostaną zapisane pod pseudonimem. Udostępnione zostaną dane kliniczne istotne dla celów badania (np. toksyczność). Dotyczy to również wszelkiej toksyczności związanej z lekiem ≥ 3. stopnia występującej od pierwszego dnia indukcji do połowy leczenia podtrzymującego.

TRT podczas leczenia podtrzymującego to głównie toksyczność hematologiczna i wątrobowa występująca w ciągu pierwszych 100 dni od rozpoczęcia leczenia podtrzymującego lub kontynuacji, a do analizy częstości występowania zostanie wykorzystany ten, który wystąpi wcześniej. Toksyczność zostanie oceniona przy użyciu Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE-wersja 5.0 - https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm#ctc_50. Wiele zdarzeń dla tego samego pacjenta zostanie również zarejestrowanych do analizy. Dane dotyczące MRD, odpowiedzi choroby po jednym tygodniu (profaza) i odpowiedzi choroby na koniec terapii steroidowej zostaną ocenione w odniesieniu do somatycznych wariantów genetycznych.

Inne wyniki kliniczne, które należy ocenić w odniesieniu do markerów genetycznych, to częstość występowania nawrotu choroby (tj. czas trwania między dniem całkowitej remisji a dniem wystąpienia nawrotu), śmiertelność niezwiązana z nawrotem nawrotu choroby) i przeżycia całkowitego (OS). Obserwacja będzie trwała co najmniej rok (jednak wszyscy pacjenci będą nadal obserwowani i zostaną ponownie przeanalizowani 5 lat po leczeniu pod kątem przeżycia) w celu oceny wyników, takich jak OS i RFS. EFS definiuje się jako czas od rozpoczęcia leczenia do pierwszego niepowodzenia indukcji, braku odpowiedzi lub progresji choroby, zgonu z jakiejkolwiek przyczyny lub jest ocenzurowany w dniu ostatniej wizyty kontrolnej. OS definiuje się jako czas od rozpoczęcia terapii do zgonu z dowolnej przyczyny. Pacjenci z Jawaharlal Institute of Post-graduate Medical Education and Research (JIPMER) i All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) odpowiedzą na kwestionariusz jakości życia w momencie diagnozy i około 100 dnia (+/- 30 dni) fazy podtrzymującej (inne punkty czasowe podczas terapii podtrzymującej zostałyby ocenione, ale nie w ramach obecnej propozycji badawczej), przy użyciu ogólnych podstawowych skal inwentarza jakości życia pediatrycznego, PedsQL (https://www.pedsql.org /). Moduł nowotworowy kwestionariusza pedSQl zostanie wdrożony, jeśli będzie gotowy do czasu rekrutacji pierwszego pacjenta zgodnie z wytycznymi Mapi Research Trust, który dostarcza te kwestionariusze po uzyskaniu licencji (https://eprovide.mapi-trust.org /). W przeciwnym razie zostanie zaimplementowany moduł ogólny. Zostaną zebrane inne dane, takie jak dane społeczno-ekonomiczne i stan odżywienia (przesłane na portal internetowy wraz z „CRF”), a zalecenia żywieniowe wdrożone w ramach rutynowego standardowego protokołu leczenia zostaną wyodrębnione i wykorzystane w czasie analizy, jeśli mają wpływ jako czynniki zakłócające na którykolwiek z wyników będących przedmiotem badania

Procedura pobierania próbek:

Próbki śliny w momencie rekrutacji, próbka krwi pełnej (3-5 ml) pobierana jest w czasie całkowitej remisji, pobrana do probówek z EDTA będzie przechowywana w temperaturze -80°C do czasu ekstrakcji. Próbki szpiku kostnego będą również pobierane do probówek z EDTA i przechowywane w temperaturze -80°C aż do ekstrakcji, podobnie jak próbki pozostałe po badaniu MRD. Próbki osocza będą również pobierane do probówek do pobierania krwi z EDTA, a separacja osocza zostanie przeprowadzona (4 ml próbki pełnej krwi) przy użyciu wirówki z wahadłowym kubkiem wirującej przez 10 minut z prędkością 1300 g względnej siły odśrodkowej. Porcje po 250 µl osocza będą przechowywane w temperaturze -80°C we wstępnie oznakowanych krioprobówkach.

Ekstrakcja DNA będzie przeprowadzana partiami, a podwielokrotność zostanie udostępniona zespołowi genewskiemu do analiz sekwencjonowania. Stężenia DNA zostaną określone za pomocą Qubit lub innej metody opartej na SYBR Green, a integralność zostanie zmierzona za pomocą Tapestation, przy czym do analiz genetycznych zostaną użyte wartości GQN większe niż 7,5. Procesy oczyszczania i oznaczania ilościowego zostały już ustanowione zarówno w ośrodkach JIPMER, jak i AIIMS. Pozostałe porcje będą przechowywane w odpowiednich biobankach. Żadne odręczne etykiety nie będą akceptowane; wszystkie etykiety zostaną należycie wydrukowane z anonimowym identyfikatorem pacjenta, typem próbki i godziną pobrania. Każdy ośrodek zapewni anonimizację próbek przed wysłaniem próbek do wspólnych analiz. Dwie porcje, każda zawierająca około 1,0 µg DNA w 50 µl 10 mM Tris (8,0), zostaną użyte do sekwencjonowania (linia zarodkowa 70X, somatyczna 150X) w analizie fazy 1 w Genewie oraz do genotypowania PCR w czasie rzeczywistym lub genotypowania w otwartej macierzy w fazie 2 analizy w Indiach. Inne porcje byłyby przechowywane w biobankach w odpowiednich ośrodkach do przyszłych badań.

Faza 1 analizy wariantów genetycznych przy użyciu sekwencjonowania całego egzomu:

Sekwencjonowanie całego egzomu zostanie przeprowadzone na platformie Genomics Platform Campus Biotech na Uniwersytecie Genewskim Przy użyciu 100 próbek DNA linii germinalnej i 100 próbek DNA z komórek białaczkowych (ci sami pacjenci), sekwencjonowanie całego egzomu będzie wykorzystywać następujący przepływ pracy zgodnie z protokołami producentów: ( i) przygotowanie biblioteki; (ii) sekwencjonowanie przy użyciu systemu HiSeq4000 ze średnim pokryciem 70X dla próbek DNA linii zarodkowej i 150X dla próbek somatycznego DNA (Illumina); (iii) integracja i przechowywanie surowych danych w systemie zarządzania informacjami laboratoryjnymi (LIMS) na platformie badawczej onko-hematologii dziecięcej na Wydziale Pediatrii, Ginekologii i Położnictwa Uniwersytetu Genewskiego. Dane zostaną udostępnione Szwajcarskiemu Instytutowi Bioinformatyki za pośrednictwem LIMS w celu uzyskania dodatkowego wkładu w analizę (analizy będą przeprowadzane głównie przez adiunkta ze stopniem doktora) oraz JIPMER i AIIMS na potrzeby przyszłych badań.

Analiza danych genetycznych:

W celu analizy danych genetycznych całe genomy zostaną wyrównane z genomem referencyjnym hg19 przy użyciu alignera Burrowsa-Wheelera, duplikaty PCR zostaną usunięte przy użyciu narzędzi PICARD, a ponowna kalibracja podstawowego wyniku jakości zostanie przeprowadzona przy użyciu zestawu narzędzi do analizy genomu (GATK). Oczyszczone pliki BAM zostaną użyte do utworzenia plików pile-up za pomocą narzędzia SAM. Warianty linii zarodkowej zostaną wywołane przy użyciu programu wywołującego haplotypy GATK, a wyniki jakości wariantów zostaną ponownie skalibrowane na podstawie publicznych zestawów danych za pomocą narzędzia Variant Recalibrate i opatrzone adnotacjami za pomocą ANNOVAR. Warianty inne niż białaczkowe zostaną następnie po prostu odjęte od wariantów białaczkowych w celu uzyskania listy wariantów specyficznych dla białaczki. Sekwencje białaczkowe i niebiałaczkowe będą również analizowane jednocześnie w celu wykrycia mutacji przy użyciu metod heurystycznych dostępnych w narzędziach Varscan i Mu Tect. Warianty, które mogą powstać z powodu błędów sekwencji, zostaną wykryte przez algorytm SAVI. Przeprowadzimy analizę za pomocą (i) podejścia genu kandydującego z filtrowanymi wariantami / mutacjami wybranych genów w oparciu o hipotezę oraz (ii) wolnej od hipotezy, obejmującej cały egzom, analizy asocjacyjnej, która skupi się na wariantach zlokalizowane w regionach eksonowych, warianty missense lub nonsensowne z przewidywanym efektem funkcjonalnym, jak również zmiany w miejscach splicingu. Przewidywany wpływ wariantów zmiany sensu na funkcje białek zostanie oceniony in silico przy użyciu SIFT i PolyPhen2 włączonych do narzędzi VEP. Filtrowanie wariantów zostanie przeprowadzone w oparciu o projekty 1000 genomów i NHLBI GO Exome Sequencing. Dokładny test Fishera (powiązanie alleliczne) i test Cochrana-Armitage'a dla trendów zostaną wdrożone w PLINK, aby szukać powiązań między wynikami klinicznymi a wariantami genetycznymi.

Analiza powiązań dla danych ilościowych i binarnych zostanie przeanalizowana przy użyciu ogólnych modeli linearyzowanych w PLINK, z progiem istotności 0,05 na liczbę wariantów dla podejść kandydujących i obejmujących cały egzom. Zostaną utworzone alternatywne analizy z wartością p 0,05, a korekty dla wielu testów zostaną przeprowadzone przy użyciu metody wskaźnika fałszywego odkrycia Benjamina-Hochberga: warianty są uważane za istotnie powiązane, jeśli mają wskaźnik fałszywego odkrycia niższy niż 5% ( dla EWAS) lub 10% (do analizy genów kandydujących).

Wybór genu kandydata:

Przypuszcza się, że warianty farmakogenetyczne wpływają na kinetykę i dynamikę leków chemioterapeutycznych w protokole leczenia (głównie uzyskanych z PharmGKB). Uwzględniono by również inne farmakogeny, które mogą mieć wpływ na funkcje fizjologiczne przyczyniające się do patofizjologii toksyczności. Zaimplementowana zostałaby częstość alleli mniejszych powyżej 15%, funkcjonalność jako kryterium filtrowania wariantów do analizy. Lista potencjalnych kandydatów znajduje się w załączniku „Germline_Genes.txt”.

Selekcja genów kandydujących do testowania wariantów somatycznych: Zestaw genów kandydujących został skompilowany po obszernym przeglądzie literatury. Te geny zostały wybrane, ponieważ: i) zostały zgłoszone w indywidualnych badaniach asocjacyjnych; ii) uczestniczą w szlakach farmakodynamicznych terapii steroidowych i innych środków chemioterapeutycznych; iii) są kluczowymi aktorami w patogenezie choroby lub szlakach immunologicznych kontroli choroby; iv) uczestniczyć w naprawie szkód spowodowanych chemioterapią i radioterapią; v) były regulowane w górę lub w dół w komórkach limfoblastoidalnych wrażliwych lub opornych na prednizolon w eksperymentach przeprowadzonych w laboratorium naszej współpracowniczki i mentorki prof. Mai Krajinovic; vi) można uzyskać za pomocą Ingenuity Pathway Analysis® specyficznej dla sterydów, chemioterapii i innych terapii wspomagających. Tylko warianty tych genów zostaną wprowadzone do analizy statystycznej w celu znalezienia powiązań. Unikalne zestawy danych populacji z brytyjskiego biobanku (podzbiór populacji indyjskiej) zostaną również wykorzystane dla określonego fenotypu w celu wybrania niektórych kandydatów. W przypadku wariantów somatycznych rozważone zostaną publiczne repozytoria danych, takie jak dane DepMap i TARGET. Zestaw genów kandydujących umożliwi zatem stworzenie bazy danych sekwencjonowania białaczki dla jednej grupy etnicznej, wraz z jej danymi klinicznymi i kontrolnymi, wszystkie uzyskane z jednego badania. Będzie to cenne źródło informacji dla badaczy badających kwestie związane z leczeniem ALL u dzieci.

Kandydackie warianty somatyczne i linii zarodkowej wykryte przez sekwencjonowanie całego egzomu zostaną zweryfikowane przy użyciu bezpośredniego sekwencjonowania Sangera po amplifikacji PCR. W przypadku obecności w głównej populacji klonów sekwencjonowanie Sangera umożliwia wykrycie mutacji w stanach heterozygotycznych. W związku z tym mutacje zgłoszone w <25% odczytów nie zostaną uwzględnione w tej fazie walidacji.

Genotypowanie fazy 2 dla wybranych kandydatów z analizy fazy 1:

Analizy fazy 2 będą obejmowały badanie przesiewowe 400 próbek DNA linii zarodkowej od 120 najlepszych kandydatów zidentyfikowanych w analizie asocjacji sekwencjonowania linii zarodkowej z TRT fazy 1. Analiza somatycznego DNA obejmuje badanie przesiewowe 150 próbek od 100 najlepszych kandydatów z analizy fazy 1. Metodologia otwartej macierzy (ThermoScientific) lub wykonane na zamówienie mikromacierze (Axiom) mogą być wykorzystane jako opłacalna strategia. Planujemy opracować opłacalną metodologię badań przesiewowych, którą można łatwo wdrożyć w celu rutynowego monitorowania wariantów najbardziej związanych z badanymi wynikami klinicznymi, np. PCR specyficzny dla alleli lub proste testy różnicowania alleli oparte na sondach lub metody analizy krzywej topnienia o wysokiej rozdzielczości . Wygenerowane dane będą przechowywane lokalnie w stałych repozytoriach danych JIPMER i AIIMS, a także będą udostępniane Genewskiej Platformie Badawczej Onko-Hematologii Pediatrycznej. Zostanie podpisana umowa z komitetem sterującym Clinical Pharmacogenomics Implementation Consortium® (CPIC) w sprawie wykorzystania danych farmakogenetycznych wygenerowanych w tym badaniu do oceny, które testy genetyczne byłyby bardziej odpowiednie dla indyjskiej populacji pacjentów, umożliwiając w ten sposób opracowanie paneli specyficznych dla populacji w przyszłości

Pomiar poziomu leku w osoczu lub krwi pełnej/krwinkach czerwonych (opcjonalnie):

Zbierane i analizowane będą również dane analityczne uzyskane z rutynowych usług monitorowania leków terapeutycznych w odniesieniu do wariantów genetycznych i wyników klinicznych. Próbki osocza lub próbki krwi pełnej będą rutynowo pobierane podczas wprowadzania i podtrzymywania w celu monitorowania poziomów i aktywności leku za pomocą metod analitycznych opartych na teście ELISA lub LC-MS/MS. Pozwoli nam to również na ocenę predyspozycji genetycznych niezależnie od poziomu leku. Poziom aktywności L-asparaginazy będzie mierzony (za pomocą testu ELISA) z osocza pobranego w dniu 3 po pierwszym wlewie. W przypadku 6-merkaptopuryny próbki pełnej krwi będą pobierane podczas ośmiu tygodni leczenia podtrzymującego (tj. między 49 a 56 dniem), a poziomy 6-merkaptopuryny, 6-tioguaniny i 6-metylomerkaptopuryny będą mierzone w krwinkach czerwonych. Podczas terapii indukcyjnej metotreksatem próbki krwi pełnej będą pobierane 48 godzin po zakończeniu infuzji. Podczas leczenia podtrzymującego metotreksatem w 7. tygodniu zostaną pobrane próbki i zostaną przeprowadzone analizy jego metabolitów. Próbki winkrystyny ​​podczas indukcji pobierano 24 godziny po zakończeniu wlewu.

Analiza markerów białkowych osocza i repozytorium materiału biologicznego do przyszłych badań:

Ta część nie jest planowana w ramach obecnego wniosku o grant badawczy, jednak zostanie przeprowadzone bankowanie próbek. W przyszłym oddzielnym projekcie lub jako kontynuacja obecnego projektu badawczego, test Proximity Extension Assay (PEA) opracowany przez Olink Proteomics AB (wyodrębniony z Uniwersytetu w Uppsali, Szwecja) zostanie wykorzystany do jednoczesnego określenia ilościowego 184 onkologii, wzrostu komórek i immunologii związane z ludzkimi biomarkerami białkowymi (do wyboru na podstawie wkładu ekspertów w tej dziedzinie i ich roli w patofizjologii). Ten test wymaga próbki o objętości mniejszej niż 10 µl osocza lub krwi i umożliwia jednoczesny pomiar panelu 92 biomarkerów białkowych i trzech próbek kontroli wewnętrznej. Ten test zostanie przeprowadzony przy użyciu 96-dołkowej płytki dla każdego panelu, wybranej oddzielnie i nie wymaga etapów przemywania. Zdolność wyniku wielu markerów do dokładnego przewidywania wyników zostanie wykryta za pomocą krzywych charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), wraz z analizami czułości i specyficzności.