Исследование фармакогеномной ассоциации у индийских детей с острым лимфобластным лейкозом (MPGx-INDALL)

Основные цели:

1. Изучить ассоциации статических вариантов зародышевой линии с ранней токсичностью, связанной с химиотерапией (токсичностью, связанной с лечением) у детей с ОЛЛ, проходящих лечение по протоколу Icicle.
2. Исследовать соматические и зародышевые генетические маркеры, связанные с эффективностью и токсичностью глюкокортикоидного ответа соответственно.
3. Для биобанка биологических образцов и клинических данных для будущих ассоциативных анализов, чтобы разработать биомаркеры эффективности и токсичности протокола лечения.

Второстепенные цели:

1. Изучить влияние возникновения ранней токсичности на качество жизни при активном лечении ОЛЛ (физическое и эмоциональное качество жизни с использованием инструмента PedsQL).
2. Оценить генетические ассоциации (соматические и зародышевые) с общей выживаемостью, безрецидивной смертностью, безрецидивной выживаемостью и бессобытийной выживаемостью.

Клинические результаты:

Все данные будут записаны непосредственно в электронную форму отчета о болезни (CRF) или в первоначальные бумажные формы ассистентом центра по клиническим исследованиям или менеджером данных с помощью медсестры-исследователя и старшего научного сотрудника, работающих в рамках проекта. Клинический исследователь каждого центра будет проверять, ставить дату и подписывать формы в электронном виде, с запланированным межцентровым и сторонним мониторингом данных. Все данные пациента будут сохранены под псевдонимом. Клинические данные, относящиеся к целям исследования, будут переданы (например, демографические данные, классификация заболеваний, тестирование минимальной остаточной болезни (МОБ), цитогенетика, детали последующего наблюдения, данные о токсичности, данные о выживаемости, данные о рецидивах, тесты функции печени, раннее лечение, связанное с токсичность). Это также будет включать любую связанную с лекарственным средством токсичность ≥ 3 степени, возникающую с первого дня индукции до середины поддерживающей терапии.

ТЗТ во время поддерживающей терапии в основном связаны с гематологической и печеночной токсичностью, возникающей в течение первых 100 дней после начала поддерживающей или продолженной терапии, и в зависимости от того, что произойдет раньше, будет использоваться для анализа заболеваемости. Токсичность будет оцениваться с использованием общих терминологических критериев нежелательных явлений (CTCAE-версия 5.0 — https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm#ctc_50. Несколько событий для одного и того же пациента также будут записаны для анализа. Данные по МОБ, ответу на заболевание через одну неделю (профаза) и ответу на заболевание в конце стероидной терапии будут оцениваться по отношению к соматическим генетическим вариантам.

Другими клиническими исходами, подлежащими оценке в отношении генетических маркеров, являются частота рецидивов заболевания (т. е. продолжительность между днем ​​полной ремиссии и днем ​​возникновения рецидива), смертность без рецидивов (смерть по любой причине, кроме рецидив заболевания) и общую выживаемость (ОВ). Последующее наблюдение будет продолжаться как минимум один год (однако все пациенты будут продолжать наблюдаться и будут снова проанализированы через 5 лет после лечения на предмет выживаемости) для оценки таких результатов, как ОВ и БВР. БСВ определяется как время от начала лечения до первой неудачи индукции, отсутствия ответа или прогрессирования заболевания, смерти от любой причины или цензурируется на дату последнего наблюдения. ОВ определяется как время от начала терапии до смерти от любой причины. Пациенты из Института последипломного медицинского образования и исследований им. Джавахарлала (JIPMER) и Всеиндийского института медицинских наук (AIIMS) будут отвечать на вопросник о качестве жизни во время постановки диагноза и примерно через 100 дней (+/-30 дней). фазы поддерживающей терапии (другие моменты времени во время поддерживающей терапии будут оцениваться, но не в рамках текущего исследовательского предложения), с использованием общих основных шкал педиатрической инвентаризации качества жизни, PedsQL (https://www.pedsql.org). /). Онкологический модуль анкеты pedSQl будет внедрен, если он будет готов к моменту набора первого пациента в соответствии с рекомендациями исследовательского фонда Mapi, который предоставляет эти анкеты после получения лицензии (https://eprovide.mapi-trust.org). /). В противном случае будет реализован общий модуль. Другие данные, такие как социально-экономические данные и данные о состоянии питания, будут собираться (загружаются на веб-портал вместе с «ИФР»), а рекомендации по питанию, реализованные как часть стандартного протокола лечения, будут извлекаться и использоваться во время анализ, если они влияют как искажающие факторы на любой из исследуемых результатов

Процедура отбора проб:

Образцы слюны во время набора, образец цельной крови (3-5 мл) собирают при полной ремиссии, собирают в пробирки с ЭДТА и замораживают при -80°C до экстракции. Образцы костного мозга также будут собираться в пробирки с ЭДТА и храниться в замороженном виде при температуре -80°C до извлечения, как и образцы, оставшиеся после тестирования MRD. Образцы плазмы также будут собраны в пробирки для сбора крови с ЭДТА, и будет выполнено разделение плазмы (4 мл образца цельной крови) с использованием центрифуги с вращающимся баком, вращающейся в течение 10 минут со скоростью 1300 g относительной центробежной силы. Аликвоты по 250 мкл плазмы будут храниться при температуре -80°C в предварительно помеченных криопробирках.

Экстракция ДНК будет проводиться партиями, а аликвота будет передана команде в Женеве для секвенирования. Концентрации ДНК будут определяться с использованием Qubit или другого метода на основе SYBR Green, а целостность будет измеряться с помощью Tapestation, при этом для генетического анализа будут использоваться значения GQN выше 7,5. Процессы очистки и количественного определения уже налажены в центрах JIPMER и AIIMS. Остальные аликвоты будут храниться в соответствующих биобанках. Написанные от руки этикетки не принимаются; все этикетки должным образом печатаются с указанием анонимного идентификатора пациента, типа образца и времени сбора. Каждый центр обеспечит анонимность образцов перед отправкой образцов для совместного анализа. Две аликвоты, каждая примерно с 1,0 мкг ДНК в 50 мкл 10 мМ Трис (8,0), будут использоваться для секвенирования (зародышевая линия 70X, соматическая 150X) в анализе фазы 1 в Женеве и для генотипирования ПЦР в реальном времени или генотипирования с открытым массивом. в анализе фазы 2 в Индии. Другие аликвоты будут храниться в биобанках в соответствующих центрах для будущих исследований.

Анализ генетических вариантов фазы 1 с использованием полноэкзомного секвенирования:

Секвенирование всего экзома будет проводиться на платформе геномики Campus Biotech в Женевском университете. Используя 100 образцов ДНК зародышевой линии и 100 образцов ДНК из лейкемических клеток (те же пациенты), секвенирование всего экзома будет использовать следующий рабочий процесс в соответствии с протоколами производителей: ( и) подготовка библиотеки; (ii) секвенирование с использованием системы HiSeq4000 со средним охватом 70X для образцов ДНК зародышевой линии и 150X для образцов соматической ДНК (Illumina); (iii) интеграция и хранение необработанных данных в системе управления лабораторной информацией (LIMS) на Платформе исследований детской онкогематологии на кафедре педиатрии, гинекологии и акушерства Женевского университета. Данные будут переданы в Швейцарский институт биоинформатики через LIMS для дополнительного вклада в анализ (анализ в основном будет выполняться научным сотрудником с докторской степенью), а также в JIPMER и AIIMS для будущих исследований.

Генетический анализ данных:

Для анализа генетических данных целые геномы будут сопоставлены с эталонным геномом hg19 с помощью выравнивателя Берроуза-Уилера, дубликаты ПЦР будут удалены с помощью инструментов PICARD, а повторная калибровка базовых показателей качества будет выполнена с использованием набора инструментов для анализа генома (GATK). Очищенные файлы BAM будут использоваться для создания файлов наложения с помощью инструмента SAM. Варианты зародышевой линии будут вызываться с использованием определителя гаплотипов GATK, а показатели качества вариантов будут перекалиброваны на основе общедоступных наборов данных с использованием инструмента перекалибровки вариантов и аннотированы с помощью ANNOVAR. Затем нелейкемические варианты будут просто вычтены из лейкемических вариантов, чтобы получить список специфических для лейкемии вариантов. Лейкемические и нелейкемические последовательности также будут анализироваться одновременно для обнаружения мутаций с использованием эвристических методов, доступных в инструментах Varscan и Mu Tect. Варианты, которые могут возникнуть из-за ошибок последовательности, будут обнаружены алгоритмом SAVI. Мы проведем анализ с помощью (i) подхода к генам-кандидатам с отфильтрованными вариантами / мутациями выбранных генов на основе гипотезы и (ii) безгипотезного, экзомного, ассоциативного анализа, основное внимание в котором будет уделено вариантам. расположенные в экзонских областях, миссенс- или нонсенс-варианты с предсказанным функциональным эффектом, а также вариации сайтов сплайсинга. Прогнозируемые эффекты миссенс-вариантов на функцию белка будут оцениваться in silico с использованием SIFT и PolyPhen2, включенных в инструменты VEP. Фильтрация вариантов будет осуществляться на основе проектов 1000 Genomes и NHLBI GO Exome Sequencing. Точный критерий Фишера (аллельная ассоциация) и критерий Кокрана-Армитиджа для выявления тенденций будут реализованы в PLINK для поиска ассоциаций между клиническими исходами и генетическими вариантами.

Ассоциативный анализ количественных и бинарных данных будет проанализирован с использованием общих линеаризованных моделей в PLINK с порогом значимости 0,05 на количество вариантов для кандидата и экзомного подхода. Будут настроены альтернативные анализы с p-значением 0,05, а корректировки для множественного тестирования будут выполнены с использованием метода частоты ложных открытий Бенджамина-Хохберга: варианты считаются значимо связанными, если они имеют частоту ложных открытий ниже 5% ( для EWAS) или 10% (для анализа генов-кандидатов).

Отбор генов-кандидатов:

Предполагается, что фармакогенетические варианты влияют на кинетику и динамику химиотерапевтических препаратов в протоколе лечения (в основном полученные от PharmGKB). Также будут включены другие фармакогены, которые могут оказывать влияние на физиологические функции, способствующие патофизиологии токсичности. Частота минорного аллеля выше 15%, функциональность как критерий фильтрации вариантов для анализа будет реализована. Список потенциальных кандидатов приведен в приложении "Germline_Genes.txt".

Отбор генов-кандидатов для тестирования соматических вариантов: после обширного обзора литературы был составлен набор генов-кандидатов. Эти гены были выбраны, потому что они: i) были обнаружены в исследованиях отдельных ассоциаций; ii) участвуют в фармакодинамических путях стероидной терапии и других химиотерапевтических агентов; iii) являются ключевыми участниками патогенеза заболевания или иммунологических путей контроля над заболеванием; iv) участвовать в восстановлении повреждений, вызванных химиотерапией и облучением; v) повышалась или понижалась регуляция лимфобластоидных клеток, чувствительных или устойчивых к преднизолону, в экспериментах, проведенных в лаборатории нашего сотрудника и наставника профессора Майи Крайинович; vi) можно получить с помощью Ingenuity Pathway Analysis®, специфичного для стероидов, химиотерапии и других методов поддерживающей терапии. Только варианты этих генов будут переданы в статистический анализ для поиска ассоциаций. Уникальные наборы данных о популяциях из британского биобанка (подмножество населения Индии) также будут использоваться для конкретного фенотипа для выбора некоторых кандидатов. Для соматических вариантов будут рассмотрены общедоступные хранилища данных, такие как данные DepMap и TARGET. Таким образом, набор генов-кандидатов позволит создать базу данных секвенирования лейкемии одной этнической группы вместе с ее клиническими и последующими данными, полученными в ходе одного исследования. Это послужит ценным ресурсом для исследователей, изучающих вопросы, связанные со ВСЕМИ видами лечения детей.

Кандидаты соматических и зародышевых вариантов, обнаруженные секвенированием всего экзома, будут проверены с использованием прямого секвенирования по Сэнгеру после амплификации ПЦР. При наличии в основной клональной популяции секвенирование по Сэнгеру позволяет обнаруживать мутации в гетерозиготных состояниях. Следовательно, мутации, зарегистрированные в < 25% прочтений, не будут включены в эту фазу проверки.

Генотипирование фазы 2 для выбранных кандидатов из анализа фазы 1:

Анализы фазы 2 будут включать в себя скрининг 400 образцов ДНК зародышевой линии из 120 лучших кандидатов, выявленных в анализе ассоциации секвенирования зародышевой линии фазы 1 с TRT. Анализ соматической ДНК включает скрининг 150 образцов из 100 лучших кандидатов из анализа фазы 1. В качестве рентабельной стратегии можно использовать методологию открытых матриц (ThermoScientific) или микроматрицы, изготовленные по индивидуальному заказу (Axiom). Мы планируем разработать экономически эффективную методологию скрининга, которую легко внедрить для рутинного мониторинга вариантов, наиболее связанных с исследуемыми клиническими исходами, например, аллель-специфическая ПЦР или простые анализы дискриминации аллелей на основе зондов или методы анализа кривых плавления с высоким разрешением. . Полученные данные будут храниться локально в постоянных репозиториях данных JIPMER и AIIMS, а также будут переданы Женевской исследовательской платформе педиатрической онкогематологии. Будет подписано соглашение с руководящим комитетом Консорциума по внедрению клинической фармакогеномики® (CPIC) об использовании фармакогенетических данных, полученных в этом исследовании, для оценки того, какие генетические тесты будут более подходящими для популяции пациентов в Индии, что позволит разработать панели для конкретных популяций. в будущем

Измерение уровня препарата в плазме или цельной крови/эритроцитах (необязательно):

Аналитические данные, полученные от рутинных служб мониторинга терапевтических препаратов, также будут собираться и анализироваться в отношении генетических вариантов и клинических исходов. Образцы плазмы или образцы цельной крови будут регулярно собираться во время индукции и поддерживающей терапии для мониторинга уровней и активности лекарств с использованием аналитических методов на основе ELISA или LC-MS/MS. Это также позволит нам оценить генетическую предрасположенность независимо от уровня препарата. Уровень активности L-аспарагиназы будет измеряться (с помощью ELISA) из плазмы, собранной на 3-й день после первой инфузии. Для 6-меркаптопурина образцы цельной крови будут собираться в течение восьми недель поддерживающей терапии (т. е. между 49 и 56 днями), а уровни 6-меркаптопурина, 6-тиогуанина и 6-метилмеркаптопурина будут измеряться в эритроцитах. Во время индукционной терапии метотрексатом образцы цельной крови берут через 48 часов после окончания инфузии. Во время поддерживающей терапии метотрексатом образцы будут собираться в течение 7-й недели и анализироваться на его метаболиты. Для винкристина во время индукции образцы собирали через 24 часа после окончания инфузии.

Анализ белков-маркеров плазмы и хранилище биологических материалов для будущих исследований:

Эта часть не запланирована в рамках текущей заявки на исследовательский грант, однако будет выполнен банк образцов. В будущем отдельном проекте или в качестве продолжения текущего исследовательского проекта будет использоваться анализ Proximity Extension Assay (PEA), разработанный Olink Proteomics AB (выделенный из Упсальского университета, Швеция), для одновременной количественной оценки 184 онкологических заболеваний, клеточного роста и иммунологии. родственные белковые биомаркеры человека (должны быть выбраны на основе информации, полученной от экспертов в данной области, и их роли в патофизиологии). Для этого анализа требуется образец менее 10 мкл плазмы или крови, и он может измерять панель из 92 белковых биомаркеров и три образца внутреннего контроля одновременно. Этот анализ будет проводиться с использованием 96-луночного планшета для каждой панели, выбранной отдельно, и он не требует этапов промывки. Способность мультимаркерной оценки точно прогнозировать результаты будет определяться с помощью кривых рабочих характеристик приемника (ROC), а также анализов чувствительности и специфичности.