Studio dell'associazione farmacogenomica su bambini indiani con leucemia linfoblastica acuta (MPGx-INDALL)

Obiettivi primari:

1. Studiare le associazioni delle varianti germinali statiche con le tossicità precoci correlate alla chemioterapia (tossicità correlate al trattamento) nei bambini con ALL sottoposti al protocollo di trattamento Icicle.
2. Studiare i marcatori genetici somatici e germinali associati rispettivamente all'efficacia e alla tossicità della risposta glucocorticoide.
3. Biobancare campioni biologici e dati clinici per future analisi di associazione al fine di sviluppare biomarcatori dell'efficacia e della tossicità del protocollo di trattamento.

Obiettivi secondari:

1. Studiare l'impatto dell'insorgenza di tossicità precoci sulla qualità della vita durante il trattamento attivo di LLA (qualità della vita fisica ed emotiva utilizzando lo strumento PedsQL).
2. Valutare le associazioni genetiche (somatiche e germinali) con la sopravvivenza globale, la mortalità senza recidiva, la sopravvivenza libera da recidiva e la sopravvivenza libera da eventi.

Esiti clinici:

Tutti i dati saranno registrati direttamente in un Case Report Form elettronico (CRF) o su moduli cartacei iniziali dall'assistente di ricerca clinica del centro o dal responsabile dei dati con l'aiuto dell'infermiere ricercatore e del ricercatore senior impiegato all'interno del progetto. L'investigatore clinico di ciascun centro controllerà, appunterà e firmerà elettronicamente i moduli, con il monitoraggio pianificato dei dati intercentrici e di terze parti. Tutti i dati del paziente verranno salvati con uno pseudonimo. Saranno condivisi dati clinici rilevanti per gli obiettivi dello studio (ad esempio, dati demografici, classificazione della malattia, test della malattia minima residua (MRD), citogenetica, dettagli di follow-up, dati sulla tossicità, dati sulla sopravvivenza, dati sulle ricadute, test di funzionalità epatica, dati relativi al trattamento precoce tossicità). Ciò includerà anche qualsiasi tossicità correlata al farmaco ≥ grado 3 verificatasi dal primo giorno di induzione fino alla metà della terapia di mantenimento.

I TRT durante la terapia di mantenimento sono principalmente tossicità ematologiche ed epatiche che si verificano entro i primi 100 giorni dall'inizio del trattamento di mantenimento o di continuazione, e quello che si verifica per primo sarà utilizzato per l'analisi dell'incidenza. Le tossicità saranno classificate utilizzando i Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE-versione 5.0 - https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm#ctc_50. Verranno registrati anche più eventi per lo stesso paziente per l'analisi. I dati su MRD, risposta di malattia a una settimana (prophase) e risposta di malattia alla fine della terapia steroidea saranno valutati in relazione alle varianti genetiche somatiche.

Altri esiti clinici da valutare in relazione ai marcatori genetici sono l'incidenza di recidiva della malattia (cioè la durata tra il giorno della remissione completa e il giorno in cui si verifica la recidiva), la mortalità non da recidiva (morte dovuta a qualsiasi causa diversa da recidiva della malattia) e sopravvivenza globale (OS). Ci sarà un follow-up minimo di un anno (Tuttavia, tutti i pazienti continueranno a essere seguiti e saranno analizzati nuovamente a 5 anni dopo il trattamento per gli esiti di sopravvivenza) per valutare esiti come OS e RFS. L'EFS è definita come il tempo dall'inizio del trattamento al primo fallimento dell'induzione, mancata risposta o progressione della malattia, morte per qualsiasi causa o è censurata alla data dell'ultimo follow-up. La OS è definita come il tempo dall'inizio della terapia alla morte per qualsiasi causa. I pazienti del Jawaharlal Institute of Post-graduate Medical Education and Research (JIPMER) e dell'All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) risponderanno a un questionario sulla qualità della vita al momento della diagnosi e intorno al giorno 100 (+/-30 giorni) della fase di mantenimento (altri punti temporali durante la terapia di mantenimento sarebbero valutati ma non nell'ambito dell'attuale proposta di ricerca), utilizzando le scale di base generiche dell'inventario della qualità della vita pediatrica, PedsQL (https://www.pedsql.org /). Il modulo sul cancro del questionario pedSQl sarà implementato se sarà pronto al momento del reclutamento del primo paziente secondo le linee guida del Mapi research trust che fornisce questi questionari dopo aver ottenuto la licenza (https://eprovide.mapi-trust.org /). Altrimenti verrà implementato un modulo generico. Verranno raccolti altri dati, come i dati sullo stato socio-economico e nutrizionale (caricati sul portale web insieme a "CRF"), e le raccomandazioni nutrizionali implementate come parte del protocollo di trattamento standard di routine saranno estratte e utilizzate al momento della analisi se hanno un impatto come fattori confondenti su uno qualsiasi dei risultati in esame

Procedura di campionamento:

Campioni di saliva al momento del reclutamento, campione di sangue intero (3-5 ml) viene raccolto a completa remissione, raccolto in provette EDTA sarà conservato congelato a -80°C fino all'estrazione. I campioni di midollo osseo saranno raccolti anche in tubi EDTA e mantenuti congelati a -80°C fino all'estrazione, così come i campioni rimasti dopo il test MRD. I campioni di plasma saranno raccolti anche in provette per la raccolta del sangue con EDTA e la separazione del plasma sarà eseguita (4 ml di campione di sangue intero) utilizzando una centrifuga a secchiello oscillante che gira per 10 minuti a una velocità di 1300 g di forza centrifuga relativa. Aliquote di 250 µL di plasma saranno conservate a -80°C in criotubi pre-etichettati.

L'estrazione del DNA verrà eseguita in lotti e un'aliquota verrà condivisa con il team di Ginevra per le analisi di sequenziamento. Le concentrazioni di DNA saranno determinate utilizzando Qubit o un altro metodo basato su SYBR Green e l'integrità sarà misurata utilizzando Tapestation, con valori GQN superiori a 7,5 utilizzati per le analisi genetiche. I processi di purificazione e quantificazione sono già stati stabiliti nei centri JIPMER e AIIMS. Le rimanenti aliquote saranno conservate nelle rispettive biobanche. Non saranno accettate etichette scritte a mano; tutte le etichette saranno debitamente stampate con un ID paziente anonimo, il tipo di campione e l'ora della raccolta. Ogni centro garantirà l'anonimizzazione del campione prima di inviare i campioni per analisi condivise. Due aliquote, ciascuna con circa 1,0 µg di DNA in 50 µl 10 mM di Tris (8.0), saranno utilizzate per il sequenziamento (linea germinale 70X, somatico 150X) nell'analisi di fase 1 a Ginevra e per la genotipizzazione PCR in tempo reale o la genotipizzazione open array nell'analisi di fase 2 in India. Altre aliquote verrebbero conservate in biobanche presso i rispettivi centri per future indagini.

Analisi delle varianti genetiche di fase 1 utilizzando il sequenziamento dell'intero esoma:

Il sequenziamento dell'intero esoma verrà eseguito presso la piattaforma genomica di Campus Biotech presso l'Università di Ginevra Utilizzando 100 campioni di DNA della linea germinale e 100 campioni di DNA da cellule leucemiche (stessi pazienti), il sequenziamento dell'intero esoma utilizzerà il seguente flusso di lavoro secondo i protocolli dei produttori: ( i) preparazione della biblioteca; (ii) sequenziamento utilizzando un sistema HiSeq4000 con una copertura media di 70X per campioni di DNA germinale e 150X per campioni di DNA somatico (Illumina); (iii) integrazione e archiviazione dei dati grezzi nel sistema di gestione delle informazioni di laboratorio (LIMS) presso la piattaforma di ricerca oncoematologica pediatrica presso il Dipartimento di pediatria, ginecologia e ostetricia dell'Università di Ginevra. I dati saranno condivisi con l'Istituto svizzero di bioinformatica tramite il LIMS, per ulteriori input nell'analisi (le analisi saranno eseguite principalmente da un borsista postdottorato), e con JIPMER e AIIMS per future indagini.

Analisi dei dati genetici:

Per l'analisi dei dati genetici, i genomi interi saranno allineati con il genoma di riferimento hg19 utilizzando un allineatore Burrows-Wheeler, i duplicati PCR verranno rimossi utilizzando gli strumenti PICARD e le ricalibrazioni del punteggio di qualità di base verranno eseguite utilizzando il Genome Analysis Toolkit (GATK). I file BAM puliti verranno utilizzati per creare file pile-up utilizzando lo strumento SAM. Le varianti della linea germinale verranno chiamate utilizzando un GATK Haplotype Caller e i punteggi di qualità delle varianti verranno ricalibrati in base ai set di dati pubblici utilizzando lo strumento Variant Recalibrate e annotati utilizzando ANNOVAR. Le varianti non leucemiche verranno quindi semplicemente sottratte dalle varianti leucemiche per ottenere un elenco di varianti leucemiche specifiche. Le sequenze leucemiche e non leucemiche saranno anche analizzate simultaneamente per rilevare le mutazioni utilizzando i metodi euristici disponibili negli strumenti Varscan e Mu Tect. Le varianti che potrebbero sorgere a causa di errori di sequenza verranno rilevate dall'algoritmo SAVI. Effettueremo l'analisi tramite (i) un approccio genico candidato con varianti/mutazioni filtrate ai geni selezionati sulla base di un'ipotesi e (ii) un'analisi di associazione priva di ipotesi, a livello di esoma, il cui focus sarà sulle varianti localizzate in regioni esoniche, varianti missenso o senza senso con effetto funzionale previsto, così come variazioni nei siti di splicing. Gli effetti previsti delle varianti missenso sulla funzione proteica saranno valutati in silico utilizzando SIFT e PolyPhen2 incorporati negli strumenti VEP. Il filtraggio delle varianti verrà eseguito sulla base dei progetti 1000 Genomes e NHLBI GO Exome Sequencing. Il test esatto di Fisher (associazione allelica) e il test Cochran-Armitage per le tendenze saranno implementati in PLINK per cercare associazioni tra esiti clinici e varianti genetiche.

L'analisi dell'associazione per i dati quantitativi e binari sarà analizzata utilizzando modelli linearizzati generali in PLINK, con una soglia di significatività di 0,05 per numero di varianti per gli approcci candidati e per l'intero esoma. Verranno impostate analisi alternative con un valore p di 0,05 e gli aggiustamenti per i test multipli verranno eseguiti utilizzando il metodo del tasso di falsa scoperta di Benjamin-Hochberg: le varianti sono considerate significativamente associate se hanno un tasso di falsa scoperta inferiore al 5% ( per EWAS) o 10% (per l'analisi del gene candidato).

Selezione del gene candidato:

Si ipotizza che le varianti farmacogenetiche influenzino la cinetica e la dinamica dei farmaci chemioterapici nel protocollo di trattamento (principalmente ottenuti da PharmGKB). Verrebbero inclusi anche altri farmacogeni che potrebbero avere un impatto sulle funzioni fisiologiche che contribuiscono alla patofisiologia delle tossicità. La frequenza dell'allele minore superiore al 15% verrebbe implementata come criterio di filtraggio delle varianti per l'analisi. Un elenco di potenziali candidati è riportato nell'allegato "Germline_Genes.txt".

Selezione del gene candidato per il test delle varianti somatiche: una serie di geni candidati è stata compilata a seguito di un'ampia revisione della letteratura. Questi geni sono stati selezionati perché: i) sono stati riportati da studi di associazione individuali; ii) partecipare ai percorsi farmacodinamici delle terapie steroidee e di altri agenti chemioterapici; iii) sono attori chiave nella patogenesi della malattia o nei percorsi immunologici del controllo della malattia; iv) partecipare alla riparazione dei danni causati dalla chemioterapia e dalle radiazioni; v) erano up- o down-regolati in cellule linfoblastoidi sensibili o resistenti al prednisolone negli esperimenti condotti nel laboratorio della nostra collaboratrice e mentore Prof. Maja Krajinovic; vi) può essere ottenuto tramite Ingenuity Pathway Analysis® specifico per steroidi, chemioterapia e altre terapie di supporto. Solo le varianti di questi geni verranno inserite nell'analisi statistica per trovare le associazioni. Verranno utilizzati anche set di dati di popolazione unici della biobanca del Regno Unito (popolazione indiana di sottoinsieme) per fenotipo specifico per selezionare alcuni dei candidati. Per le varianti somatiche verrebbero presi in considerazione archivi di dati pubblici come i dati DepMap e TARGET. L'insieme di geni candidati consentirà quindi la creazione di un database di sequenziamento della leucemia di una singola etnia, insieme ai suoi dati clinici e di follow-up, tutti ottenuti da un singolo studio. Questo servirà come risorsa preziosa per i ricercatori che indagano su questioni relative a TUTTO il trattamento nei bambini.

Le varianti somatiche e germinali candidate rilevate dal sequenziamento dell'intero esoma saranno convalidate utilizzando il sequenziamento diretto di Sanger dopo l'amplificazione PCR. Quando presente in una popolazione clonale importante, il sequenziamento di Sanger consente il rilevamento di mutazioni negli stati eterozigoti. Pertanto, le mutazioni riportate in <25% delle letture non saranno incluse in questa fase di validazione.

Genotipizzazione di fase 2 per i candidati selezionati dall'analisi di fase 1:

Le analisi di fase 2 includeranno lo screening di 400 campioni di DNA della linea germinale dai 120 migliori candidati identificati nell'analisi di associazione del sequenziamento della linea germinale con TRT della fase 1. L'analisi del DNA somatico include lo screening di 150 campioni dai primi 100 candidati dall'analisi di fase 1. Una metodologia open-array (ThermoScientific) o microarray su misura (Axiom) potrebbero essere utilizzati come strategia conveniente. Abbiamo in programma di sviluppare una metodologia di screening conveniente che sia facile da implementare per il monitoraggio di routine delle varianti più associate agli esiti clinici studiati, ad esempio PCR allele-specifica o semplici saggi di discriminazione allelica basati su sonda o metodi di analisi della curva di fusione ad alta risoluzione . I dati generati saranno archiviati localmente negli archivi di dati permanenti di JIPMER e AIIMS e saranno anche condivisi con la piattaforma di ricerca oncoematologica pediatrica di Ginevra. Verrà firmato un accordo con il comitato direttivo del Clinical Pharmacogenomics Implementation Consortium® (CPIC) sull'utilizzo dei dati farmacogenetici generati in questo studio per valutare quali test genetici sarebbero più appropriati per la popolazione di pazienti indiana, consentendo così lo sviluppo di panel specifici per la popolazione in futuro

Misurazione dei livelli di farmaco nel plasma o nel sangue intero/globuli rossi (facoltativo):

Verranno inoltre raccolti e analizzati i dati analitici ottenuti dai servizi di monitoraggio terapeutico di routine dei farmaci in relazione alle varianti genetiche e agli esiti clinici. Campioni di plasma o campioni di sangue intero saranno raccolti di routine durante l'induzione e il mantenimento per monitorare i livelli e l'attività del farmaco utilizzando ELISA o metodi analitici basati su LC-MS/MS. Questo ci permetterà anche di valutare le predisposizioni genetiche indipendentemente dai livelli di farmaco. Il livello di attività della L-asparaginasi sarà misurato (usando ELISA) dal plasma raccolto al giorno 3 dopo la prima infusione. Per la 6-mercaptopurina, i campioni di sangue intero saranno raccolti durante le otto settimane di terapia di mantenimento (cioè, tra i giorni 49 e 56), e i livelli di 6-mercaptopurina, 6-tioguanina e 6-metil mercaptopurina saranno misurati nei globuli rossi. Durante la terapia di induzione con metotrexato, verranno prelevati campioni di sangue intero 48 ore dopo la fine dell'infusione. Durante la terapia di mantenimento con metotrexato, i campioni verranno raccolti durante la settimana 7 e verranno analizzati i suoi metaboliti. Per la vincristina durante l'induzione i campioni sono stati raccolti 24 ore dopo la fine dell'infusione.

Analisi dei marcatori proteici plasmatici e deposito di materiale biologico per studi futuri:

Questa parte non è prevista nell'ambito dell'attuale domanda di assegno di ricerca, tuttavia, verrà eseguita la raccolta di campioni. In un futuro progetto separato o come continuazione dell'attuale progetto di ricerca, il Proximity Extension Assay (PEA) sviluppato da Olink Proteomics AB (scorporata dall'Università di Uppsala, Svezia) sarà utilizzato per quantificare simultaneamente 184 oncologia, crescita cellulare e immunologia biomarcatori proteici umani correlati (da scegliere sulla base del contributo di esperti del settore e del loro ruolo nella fisiopatologia). Questo test richiede un campione inferiore a 10 µL di plasma o sangue e può misurare contemporaneamente un pannello di 92 biomarcatori proteici e tre campioni di controllo interno. Questo test verrà eseguito utilizzando una piastra a 96 pozzetti per ciascun pannello, selezionato separatamente, e non richiede passaggi di lavaggio. La capacità del punteggio multimarcatore di prevedere con precisione i risultati verrà rilevata utilizzando le curve caratteristiche operative del ricevitore (ROC), insieme alle analisi di sensibilità e specificità.