급성 림프구성 백혈병을 앓고 있는 인도 어린이의 약물유전체학 협회 연구 (MPGx-INDALL)

주요 목표:

1. 고드름 치료 프로토콜을 받는 ALL을 가진 어린이의 초기 화학 요법 관련 독성(치료 관련 독성)과 정적 생식계열 변이의 연관성을 연구합니다.
2. 글루코코르티코이드 반응의 효능 및 독성과 관련된 체세포 및 생식계열 유전자 마커를 각각 조사하기 위함.
3. 치료 프로토콜의 효능 및 독성에 대한 바이오마커를 개발하기 위해 향후 연관 분석을 위한 바이오뱅크 생물학적 샘플 및 임상 데이터.

보조 목표:

1. 활성 ALL 치료(PedsQL 도구를 사용한 신체적 및 감정적 삶의 질) 동안 삶의 질에 대한 초기 독성 발생의 영향을 연구합니다.
2. 전체 생존, 비재발 사망률, 무재발 생존 및 사건 없는 생존과 유전적 연관성(체세포 및 생식계열)을 평가합니다.

임상 결과:

모든 데이터는 연구 간호사 및 프로젝트에 고용된 선임 연구원의 도움을 받아 센터의 임상 연구 조교 또는 데이터 관리자가 전자 사례 보고서 양식(CRF) 또는 초기 종이 기반 양식에 직접 기록합니다. 각 센터의 임상 조사관은 계획된 센터 간 및 제3자 데이터 모니터링을 통해 양식을 전자적으로 확인하고 날짜를 기입하고 서명합니다. 모든 환자 데이터는 가명으로 저장됩니다. 연구 목적과 관련된 임상 데이터가 공유됩니다(예: 인구통계, 질병 분류, 최소 잔여 질병(MRD) 테스트, 세포 유전학, 후속 세부 정보, 독성 데이터, 생존 데이터, 재발 데이터, 간 기능 테스트, 조기 치료 관련 독성). 여기에는 유도 첫날부터 유지 요법 중간까지 발생하는 3등급 이상의 모든 약물 관련 독성도 포함됩니다.

유지 요법 중 TRT는 주로 유지 요법 또는 지속 요법 개시 후 첫 100일 이내에 발생하는 혈액학적 및 간 독성이며, 먼저 발생한 것을 발생률 분석에 사용합니다. 독성은 부작용에 대한 일반 용어 기준(CTCAE 버전 5.0 - https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm#ctc_50)을 사용하여 등급이 매겨집니다. 동일한 환자에 대한 여러 이벤트도 분석을 위해 기록됩니다. MRD에 대한 데이터, 1주에서의 질병 반응(prophase) 및 스테로이드 요법 종료 시 질병 반응은 체세포 유전적 변이와 관련하여 평가될 것이다.

유전적 지표와 관련하여 평가할 기타 임상 결과는 질병의 재발률(즉, 완전한 관해일과 재발 발생일 사이의 기간), 비재발 사망률(질병 이외의 원인으로 인한 사망)입니다. 질병의 재발) 및 전체 생존(OS). OS 및 RFS와 같은 결과를 평가하기 위해 최소 1년의 후속 조치가 있을 것입니다(그러나, 모든 환자는 계속 추적될 것이며 생존 결과에 대해 치료 후 5년에 다시 분석될 것입니다). EFS는 치료 시작부터 첫 번째 유도 실패, 무반응 또는 질병의 진행, 모든 원인으로 인한 사망 또는 마지막 추적 날짜에서 검열될 때까지의 시간으로 정의됩니다. OS는 치료 시작부터 모든 원인으로 인한 사망까지의 시간으로 정의됩니다. Jawaharlal Institute of Post-graduate Medical Education and Research(JIPMER) 및 All India Institute of Medical Sciences(AIIMS)의 환자는 진단 시점과 약 100일(+/-30일)에 삶의 질 설문지에 응답합니다. 소아 삶의 질 인벤토리의 일반적인 핵심 척도인 PedsQL(https://www.pedsql.org /). pedSQl 설문지의 암 모듈은 라이선스 취득 시 설문지를 공급하는 Mapi Research Trust의 지침에 따라 첫 번째 환자 모집 시점까지 준비가 되면 구현됩니다(https://eprovide.mapi-trust.org). /). 그렇지 않으면 일반 모듈이 구현됩니다. 기타 사회경제적, 영양상태 데이터 등의 데이터를 수집하고("CRF"와 함께 포털에 업로드) 일상적인 표준 치료 프로토콜의 일부로 구현된 영양 권장 사항을 추출하여 사용합니다. 조사 중인 결과에 혼동 요인으로 영향을 미치는 경우 분석

샘플링 절차:

모집 시 타액 샘플, 전혈 샘플(3-5 ml)은 완전한 관해 상태에서 수집되며, EDTA 튜브에 수집되어 추출될 때까지 -80°C에서 냉동 보관됩니다. 골수 샘플도 EDTA 튜브에 수집되어 추출될 때까지 -80°C에서 냉동 보관되며, MRD 테스트 후 남은 샘플도 마찬가지입니다. 혈장 샘플도 EDTA 혈액 수집 튜브에 수집하고, 1300g의 상대 원심력 속도로 10분 동안 회전하는 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 혈장 분리(4ml 전혈 샘플)를 수행합니다. 혈장 250µL의 분취량은 사전 라벨이 부착된 저온 튜브에 -80°C로 보관됩니다.

DNA 추출은 배치로 수행되며 분취량은 시퀀싱 분석을 위해 Geneva 팀과 공유됩니다. DNA 농도는 Qubit 또는 다른 SYBR Green 기반 방법을 사용하여 결정되며 무결성은 Tapestation을 사용하여 측정되며 7.5보다 큰 GQN 값이 유전자 분석에 사용됩니다. 정화 및 정량화 프로세스는 JIPMER 및 AIIMS 센터 모두에서 이미 확립되었습니다. 나머지 분취량은 각각의 바이오뱅크에 저장됩니다. 손으로 쓴 라벨은 허용되지 않습니다. 모든 라벨에는 익명의 환자 ID, 샘플 유형 및 수집 시간이 적법하게 인쇄됩니다. 각 센터는 공유 분석을 위해 샘플을 보내기 전에 샘플 익명화를 보장합니다. 50µl 10mM Tris(8.0)에 각각 약 1.0µg의 DNA가 포함된 2개의 분취량은 Geneva에서 1상 분석의 시퀀싱(germline 70X, somatic 150X)과 실시간 PCR 유전형 분석 또는 개방형 배열 유전형 분석에 사용됩니다. 인도의 2상 분석에서. 다른 분취량은 향후 조사를 위해 각 센터의 바이오뱅크에 저장됩니다.

Whole-exome sequencing을 이용한 1상 유전자 변이 분석:

Whole-exome sequencing은 University of Geneva에 있는 Campus Biotech의 Genomics Platform에서 수행됩니다. 100개의 생식계열 DNA 샘플과 백혈병 세포(동일한 환자)의 100개 DNA 샘플을 사용하여 전체 엑솜 시퀀싱은 제조업체의 프로토콜에 따라 다음 작업 흐름을 사용합니다. i) 라이브러리 준비; (ii) 생식계열 DNA 샘플의 평균 커버리지가 70X이고 체세포 DNA 샘플의 경우 150X인 HiSeq4000 시스템을 사용한 시퀀싱(Illumina); (iii) 제네바 대학의 소아과, 산부인과 및 산부인과의 소아 종양혈액학 연구 플랫폼에 있는 검사실 정보 관리 시스템(LIMS)의 원시 데이터 통합 ​​및 저장. 데이터는 LIMS를 통해 스위스 생물정보학 연구소와 공유되어 분석에 대한 추가 입력(분석은 주로 박사 후 연구원이 수행함) 및 향후 조사를 위해 JIPMER 및 AIIMS와 공유됩니다.

유전 데이터 분석:

유전자 데이터 분석을 위해 Burrows-Wheeler 정렬기를 사용하여 전체 게놈을 hg19 참조 게놈과 정렬하고, PICARD 도구를 사용하여 PCR 중복을 제거하고, GATK(Genome Analysis Toolkit)를 사용하여 기본 품질 점수 재보정을 수행합니다. 정리된 BAM 파일은 SAM 도구를 사용하여 쌓임 파일을 만드는 데 사용됩니다. 생식계열 변이체는 GATK Haplotype Caller를 사용하여 호출되며 변이체 품질 점수는 Variant Recalibrate 도구를 사용하여 공개 데이터 세트를 기반으로 재조정되고 ANNOVAR를 사용하여 주석이 추가됩니다. 그런 다음 비백혈병 변이체를 백혈병 변이체에서 간단히 빼서 백혈병 특정 변이체 목록을 얻습니다. 백혈병 및 비백혈병 서열도 동시에 분석하여 Varscan 및 Mu Tect 도구에서 사용할 수 있는 휴리스틱 방법을 사용하여 돌연변이를 검출합니다. 시퀀스 오류로 인해 발생할 수 있는 변형은 SAVI 알고리즘에 의해 감지됩니다. 우리는 (i) 가설에 기초하여 선택된 유전자에 대해 필터링된 변이/돌연변이가 있는 후보 유전자 접근법, 및 (ii) 가설이 없는, 엑솜 차원의 연관 분석을 통해 분석을 수행할 것입니다. 이 분석의 초점은 변이에 있습니다. 스플라이싱 부위의 변이뿐만 아니라 기능적 효과가 예측되는 엑소닉 영역, 미스센스 또는 넌센스 변이체에 위치합니다. 단백질 기능에 대한 미스센스 변이체의 예상 효과는 VEP 도구에 통합된 SIFT 및 PolyPhen2를 사용하여 in silico에서 평가됩니다. 변이체 필터링은 1000 Genomes 및 NHLBI GO Exome Sequencing 프로젝트를 기반으로 수행됩니다. 경향에 대한 Fisher의 정확한 테스트(대립유전자 연관성) 및 Cochran-Armitage 테스트는 PLINK에서 구현되어 임상 결과와 유전적 변이 사이의 연관성을 검색합니다.

정량 및 이진 데이터에 대한 연관성 분석은 PLINK의 일반 선형화 모델을 사용하여 분석되며 후보 및 엑솜 전체 접근 방식에 대한 변형 수당 0.05의 유의성 임계값이 있습니다. p-값이 0.05인 대체 분석이 설정되고 여러 테스트에 대한 조정이 Benjamin-Hochberg 잘못된 발견률 방법을 사용하여 수행됩니다. 변형은 잘못된 발견률이 5% 미만인 경우 유의미하게 연관된 것으로 간주됩니다( EWAS의 경우) 또는 10%(후보 유전자 분석의 경우).

후보 유전자 선택:

약물유전학적 변이체는 치료 프로토콜(주로 PharmGKB에서 얻음)에서 화학요법 약물의 동역학 및 역학에 영향을 미치는 것으로 가정됩니다. 독성의 병태생리학에 기여하는 생리학적 기능에 영향을 미칠 수 있는 다른 약리유전자도 포함됩니다. 15% 이상의 마이너 대립유전자 빈도, 분석을 위한 변형 필터링 기준으로서의 기능이 구현됩니다. 잠재적 후보 목록은 부록 "Germline_Genes.txt"에 나와 있습니다.

체세포 변이 테스트를 위한 후보 유전자 선택: 후보 유전자 세트는 광범위한 문헌 검토에 따라 편집되었습니다. 이러한 유전자는 다음과 같은 이유로 선택되었습니다. i) 개별 연관 연구에 의해 보고되었습니다. ii) 스테로이드 요법 및 기타 화학요법제의 약력학적 경로에 참여; iii) 질병 발병기전 또는 질병 통제의 면역학적 경로의 주요 행위자입니다. iv) 화학 요법 및 방사선으로 인한 손상 복구에 참여합니다. v) 공동 작업자이자 멘토인 Maja Krajinovic 교수의 연구실에서 수행된 실험에서 프레드니솔론에 민감하거나 내성이 있는 림프모세포양 세포에서 상향 또는 하향 조절되었습니다. vi) 스테로이드, 화학 요법 및 기타 지지 치료 요법에 특정한 Ingenuity Pathway Analysis®를 통해 얻을 수 있습니다. 이러한 유전자의 변이체만이 연관성을 찾기 위해 통계 분석에 입력됩니다. 영국 바이오뱅크(인도 인구 하위 집합)의 고유한 인구 데이터 세트는 특정 표현형에 활용되어 일부 후보를 선택합니다. 체세포 변형의 경우 DepMap 및 TARGET 데이터와 같은 공용 데이터 저장소가 고려됩니다. 따라서 후보 유전자 세트는 단일 연구에서 얻은 모든 임상 및 후속 데이터와 함께 단일 민족의 백혈병 시퀀싱 데이터베이스를 생성할 수 있습니다. 이것은 어린이의 ALL 치료와 관련된 질문을 조사하는 연구원에게 귀중한 자원이 될 것입니다.

전체 엑솜 시퀀싱에 의해 검출된 후보 체세포 및 생식계열 변이체는 PCR 증폭 후 직접 Sanger 시퀀싱을 사용하여 검증됩니다. 주요 클론 집단에 존재하는 경우 Sanger 시퀀싱을 통해 이형 접합 상태의 돌연변이를 감지할 수 있습니다. 따라서 읽기의 < 25%에서 보고된 돌연변이는 이 검증 단계에 포함되지 않습니다.

1단계 분석에서 선택된 후보에 대한 2단계 유전형 분석:

2단계 분석에는 TRT를 사용한 1단계 생식계열 염기서열 분석에서 확인된 상위 120개 후보의 400개 생식계열 DNA 샘플 스크리닝이 포함됩니다. 체세포 DNA 분석에는 1단계 분석에서 상위 100개 후보의 150개 샘플에 대한 스크리닝이 포함됩니다. 오픈 어레이 방법론(ThermoScientific) 또는 맞춤형 마이크로어레이(Axiom)를 비용 효율적인 전략으로 사용할 수 있습니다. 대립유전자 특이적 PCR 또는 단순 프로브 기반 대립유전자 식별 분석 또는 고해상도 용융 곡선 분석 방법과 같이 조사된 임상 결과와 가장 관련이 있는 변이체의 일상적인 모니터링을 위해 구현하기 쉬운 비용 효율적인 스크리닝 방법론을 개발할 계획입니다. . 생성된 데이터는 JIPMER 및 AIIMS의 영구 데이터 저장소에 로컬로 저장되며 Geneva의 Pediatric Onco-Hematology Research Platform과도 공유됩니다. CPIC(Clinical Pharmacogenomics Implementation Consortium®) 운영 위원회와 이 연구에서 생성된 약물 유전학 데이터를 사용하여 인도 환자 집단에 어떤 유전자 검사가 더 적합한지 평가하는 계약을 체결하여 인구별 패널 개발을 가능하게 합니다. 앞으로는

혈장 또는 전혈/적혈구에서 약물 수준 측정(선택 사항):

일상적인 치료 약물 모니터링 서비스에서 얻은 분석 데이터도 유전 변이 및 임상 결과와 관련하여 수집 및 분석됩니다. 혈장 샘플 또는 전혈 샘플은 ELISA 또는 LC-MS/MS 기반 분석 방법을 사용하여 약물 수준 및 활성을 모니터링하기 위해 유도 및 유지 중에 일상적으로 수집됩니다. 이를 통해 약물 수준과 무관하게 유전적 소인을 평가할 수 있습니다. L-아스파라기나제의 활성 수준은 첫 번째 주입 후 3일에 수집된 혈장에서 측정됩니다(ELISA 사용). 6-메르캅토퓨린의 경우, 유지 요법 8주 동안(즉, 49일에서 56일 사이) 전혈 샘플을 수집하고 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌 및 6-메틸 메르캅토퓨린 수치를 적혈구에서 측정합니다. 메토트렉세이트 유도 요법 동안 전혈 샘플은 주입 종료 후 48시간 후에 채취됩니다. 메토트렉세이트 유지 요법 동안 샘플은 7주 동안 수집되고 대사산물이 분석됩니다. 유도 중 빈크리스틴의 경우 주입 종료 후 24시간에 샘플을 수집했습니다.

향후 연구를 위한 혈장 단백질 마커 분석 및 생물학적 물질 저장소:

이 부분은 현재 연구 보조금 신청에 따라 수행될 계획이 없지만 샘플 뱅킹이 수행됩니다. 향후 별도의 프로젝트 또는 현재 연구 프로젝트의 연속으로 Olink Proteomics AB(스웨덴 웁살라 대학에서 분사)가 개발한 PEA(Proximity Extension Assay)를 사용하여 184종양학, 세포 성장 및 면역학을 동시에 정량화할 것입니다. -관련 인간 단백질 바이오마커(해당 분야 전문가의 입력과 병태생리학에서의 역할에 따라 선택). 이 분석은 10µL 미만의 혈장 또는 혈액 샘플이 필요하며 92개의 단백질 바이오마커 패널과 3개의 내부 대조 샘플을 한 번에 측정할 수 있습니다. 이 분석은 별도로 선택된 각 패널에 대해 96웰 플레이트를 사용하여 수행되며 세척 단계가 필요하지 않습니다. 다중 마커 점수의 결과를 정확하게 예측하는 능력은 감도 및 특이성 분석과 함께 수신자 작동 특성(ROC) 곡선을 사용하여 감지됩니다.