Farmakogenomisen yhdistyksen tutkimus intialaisilla lapsilla, joilla on akuutti lymfoblastinen leukemia (MPGx-INDALL)

Ensisijaiset tavoitteet:

1. Tutkia staattisten ituratavarianttien yhteyksiä varhaiseen kemoterapiaan liittyviin toksisuuksiin (hoitoon liittyviin toksisuuksiin) lapsilla, joilla on ALL ja jotka käyvät Icicle-hoitoprotokollaa.
2. Tutkia somaattisia ja ituradan geneettisiä markkereita, jotka liittyvät glukokortikoidivasteen tehokkuuteen ja toksisuuteen.
3. Biopankkiin biologiset näytteet ja kliiniset tiedot tulevia assosiaatioanalyysejä varten, jotta voidaan kehittää hoitoprotokollan tehokkuuden ja toksisuuden biomarkkereita.

Toissijaiset tavoitteet:

1. Tutkia varhaisten toksisuuksien esiintymisen vaikutusta elämänlaatuun aktiivisen ALL-hoidon aikana (fyysinen ja emotionaalinen elämänlaatu PedsQL-työkalulla).
2. Arvioida geneettisiä assosiaatioita (somaattinen ja iturata) kokonaiseloonjäämisen, ei-relapsoituneen kuolleisuuden, uusiutumisvapaan eloonjäämisen ja tapahtumattoman eloonjäämisen kanssa.

Kliiniset tulokset:

Keskuksen kliinisen tutkimuksen assistentti tai tietopäällikkö tallentaa kaikki tiedot suoraan sähköiseen tapausraporttilomakkeeseen (CRF) tai paperipohjaisille alkulomakkeille hankkeessa työskentelevän tutkimushoitajan ja vanhemman tutkijan avustuksella. Jokaisen keskuksen kliininen tutkija tarkistaa, päivätää ja allekirjoittaa lomakkeet sähköisesti. Suunniteltu keskusten välinen ja kolmannen osapuolen tietojen seuranta. Kaikki potilastiedot tallennetaan salanimellä. Tutkimuksen tavoitteiden kannalta merkitykselliset kliiniset tiedot jaetaan (esim. väestötiedot, sairauden luokitus, minimaalisen jäännössairauden (MRD) testaus, sytogenetiikka, seurantatiedot, toksisuustiedot, eloonjäämistiedot, relapsitiedot, maksan toimintatestit, varhaiseen hoitoon liittyvät tiedot toksisuus). Tämä sisältää myös lääkkeeseen liittyvän toksisuuden, joka on ≥ asteen 3 ja joka ilmenee ensimmäisestä aloituspäivästä ylläpitohoidon puoliväliin.

Ylläpitohoidon aikaiset TRT:t ovat pääasiassa hematologisia ja maksatoksisia vaikutuksia, joita esiintyy ensimmäisten 100 päivän aikana ylläpito- tai jatkohoidon aloittamisesta, ja ilmaantuvuusanalyysissä käytetään sitä, kumpi tapahtuu ensin. Myrkyllisyydet luokitellaan haitallisten tapahtumien yleisten terminologian kriteerien mukaan (CTCAE-versio 5.0 - https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm#ctc_50). Saman potilaan useita tapahtumia tallennetaan myös analysointia varten. Tiedot MRD:stä, sairauden vasteesta viikon kuluttua (profaasi) ja taudin vasteesta steroidihoidon lopussa arvioidaan suhteessa somaattisiin geneettisiin variantteihin.

Muita kliinisiä tuloksia, jotka on arvioitava suhteessa geneettisiin markkereihin, ovat sairauden uusiutumisen ilmaantuvuus (eli kesto täydellisen remissiopäivän ja uusiutumisen ilmenemispäivän välillä), ei-relapse-kuolleisuus (kuolema mistä tahansa muusta syystä kuin taudin uusiutuminen) ja kokonaiseloonjääminen (OS). Seuranta kestää vähintään vuoden (kaikkien potilaiden seurantaa kuitenkin jatketaan ja eloonjäämistulokset analysoidaan uudelleen 5 vuoden kuluttua hoidon jälkeen) tulosten, kuten OS:n ja RFS:n, arvioimiseksi. EFS määritellään ajaksi hoidon aloittamisesta ensimmäiseen induktion epäonnistumiseen, vasteen puuttumiseen tai taudin etenemiseen, mistä tahansa syystä johtuvaan kuolemaan, tai se sensuroidaan viimeisen seurantapäivänä. Käyttöjärjestelmä määritellään ajaksi hoidon aloittamisesta mistä tahansa syystä johtuvaan kuolemaan. Jawaharlal Institute of Medical Education and Research (JIPMER) ja All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) potilaat vastaavat elämänlaatukyselyyn diagnoosin yhteydessä ja noin 100. päivänä (+/-30 päivää) ylläpitovaiheen (muita ylläpitohoidon aikapisteitä arvioitaisiin, mutta ei nykyisen tutkimusehdotuksen piiriin) käyttämällä yleisiä perusasteikkoja lasten elämänlaatukartoituksesta, PedsQL (https://www.pedsql.org). /). pedSQl-kyselylomakkeen syöpämoduuli otetaan käyttöön, jos se on valmis ensimmäisen potilaan rekrytointihetkeen mennessä lisenssin hankinnan yhteydessä näitä kyselyitä toimittavan Mapi-tutkimussäätiön ohjeiden mukaisesti (https://eprovide.mapi-trust.org). /). Muussa tapauksessa yleinen moduuli otetaan käyttöön. Muut tiedot, kuten sosioekonomiset ja ravitsemustilatiedot kerätään (ladattuna verkkoportaaliin yhdessä "CRF":n kanssa), ja rutiininomaisen hoitoprotokollan osana toteutetut ravitsemussuositukset poimitaan ja niitä käytetään hoidon aikana. analysoida, jos niillä on sekaannusvaikutus johonkin tutkimuksen kohteena olevista tuloksista

Näytteenottomenettely:

Sylkinäytteet rekrytoinnin yhteydessä, kokoverinäyte (3-5 ml) kerätään täydellisen remission jälkeen, kerätään EDTA-putkiin ja säilytetään jäädytettynä -80 °C:ssa uuttamiseen asti. Luuydinnäytteet kerätään myös EDTA-putkiin ja säilytetään pakastettuna -80 °C:ssa uuttamiseen asti, samoin kuin MRD-testauksen jälkeen jääneet näytteet. Plasmanäytteet kerätään myös EDTA-verenkeräysputkiin ja plasman erotus suoritetaan (4 ml kokoverinäyte) käyttämällä heiluvaa ämpäriä olevaa sentrifugia pyörittämällä 10 minuuttia nopeudella 1300 g suhteellista keskipakovoimaa. 250 µl:n alikvootit plasmaa säilytetään -80 °C:ssa esileimatuissa kryoputkissa.

DNA-uutto suoritetaan erissä, ja alikvootti jaetaan Geneven tiimin kanssa sekvensointianalyysejä varten. DNA-pitoisuudet määritetään Qubitilla tai muulla SYBR Green -pohjaisella menetelmällä ja eheys mitataan Tapestationilla, jolloin geneettisissä analyyseissä käytetään GQN-arvoja, jotka ovat suurempia kuin 7,5. Puhdistus- ja kvantifiointiprosessit on jo perustettu sekä JIPMER- että AIIMS-keskuksissa. Loput alikvootit varastoidaan vastaaviin biopankkeihin. Käsinkirjoitettuja tarroja ei hyväksytä; kaikki etiketit tulostetaan asianmukaisesti, ja niissä on anonymisoitu potilastunnus, näytetyyppi ja keräysaika. Jokainen keskus varmistaa näytteiden anonymisoinnin ennen näytteiden lähettämistä yhteisiin analyyseihin. Kaksi alikvoottia, joista kummassakin on noin 1,0 µg DNA:ta 50 µl:ssa 10 mM Tris:ä (8,0), käytetään sekvensointiin (idulinja 70X, somaattinen 150X) vaiheen 1 analyysissä Genevessä ja reaaliaikaiseen PCR-genotyypitykseen tai avoimen ryhmän genotyypitykseen. vaiheen 2 analyysissä Intiassa. Muut alikvootit säilytettäisiin vastaavissa keskuksissa oleviin biopankkeihin tulevia tutkimuksia varten.

Vaiheen 1 geneettinen varianttianalyysi kokoeksomin sekvensointia käyttäen:

Koko eksomin sekvensointi suoritetaan Campus Biotechin Genomics Platformissa Geneven yliopistossa käyttäen 100 ituradan DNA-näytettä ja 100 DNA-näytettä leukemiasoluista (samat potilaat), koko eksomin sekvensointi käyttää seuraavaa työnkulkua valmistajien protokollien mukaisesti: ( i) kirjaston valmistelu; (ii) sekvensointi käyttäen HiSeq4000-järjestelmää, jonka keskimääräinen peitto on 70X ituradan DNA-näytteille ja 150X somaattisille DNA-näytteille (Illumina); (iii) raakadatan integrointi ja tallennus laboratoriotietojen hallintajärjestelmään (LIMS) Geneven yliopiston pediatrian, gynekologian ja synnytystieteen laitoksen pediatrisen onko-hematologian tutkimuskeskuksessa. Tiedot jaetaan Swiss Institute of Bioinformatics -instituutin kanssa LIMS:n kautta lisäsyötettä varten analyysiin (analyysit suorittaa pääasiassa tohtorintutkija) ja JIPMER:n ja AIIMS:n kanssa tulevia tutkimuksia varten.

Geneettisen tiedon analyysi:

Geneettisen datan analyysiä varten kokonaiset genomit kohdistetaan hg19-referenssigenomiin Burrows-Wheeler-kohdistuslaitteella, PCR-kopiot poistetaan PICARD-työkaluilla ja peruslaatupisteiden uudelleenkalibroinnit suoritetaan Genome Analysis Toolkit (GATK) -työkalulla. Puhdistettuja BAM-tiedostoja käytetään kasattujen tiedostojen luomiseen SAM-työkalulla. Sukulinjan variantteja kutsutaan käyttämällä GATK Haplotype Caller -ohjelmaa, ja muunnelman laatupisteet kalibroidaan uudelleen julkisten tietojoukkojen perusteella Variant Recalibrate -työkalulla ja merkitään ANNOVAR:n avulla. Ei-leukeemiset variantit yksinkertaisesti vähennetään leukemiavarianteista leukemiaspesifisen varianttiluettelon saamiseksi. Leukeemiset ja ei-leukeemiset sekvenssit analysoidaan myös samanaikaisesti mutaatioiden havaitsemiseksi Varscan- ja Mu Tect -työkalujen heuristisilla menetelmillä. SAVI-algoritmi havaitsee muunnelmat, jotka saattavat syntyä sekvenssivirheiden vuoksi. Suoritamme analyysin (i) kandidaattigeenilähestymistavan avulla, jossa on suodatettuja variantteja/mutaatioita valittuihin geeneihin hypoteesin perusteella, ja (ii) hypoteesivapaalla, eksominlaajuisella assosiaatioanalyysillä, jonka painopiste on varianteissa. eksonisilla alueilla sijaitsevat missense- tai nonsense-variantit, joilla on ennustettu toiminnallinen vaikutus, sekä vaihtelut silmukointikohdissa. Missense-varianttien ennustetut vaikutukset proteiinien toimintaan arvioidaan in silico käyttämällä VEP-työkaluihin sisällytettyä SIFT:tä ja PolyPhen2:ta. Varianttien suodatus suoritetaan 1000 genomin ja NHLBI GO Exome Sequencing -projektien perusteella. Fisherin tarkka testi (alleelinen assosiaatio) ja Cochran-Armitage-testi trendien selvittämiseksi toteutetaan PLINKissä kliinisten tulosten ja geneettisten varianttien välisten assosiaatioiden etsimiseksi.

Kvantitatiivisten ja binääritietojen assosiaatioanalyysi analysoidaan käyttämällä yleisiä linearisoituja malleja PLINKissä, merkitsevyyskynnyksellä 0,05 vaihtoehtojen lukumäärää kohden ehdokas- ja eksominlaajuisille lähestymistavoille. Vaihtoehtoisia analyysejä, joiden p-arvo on 0,05, asetetaan ja säädöt useille testauksille suoritetaan käyttämällä Benjamin-Hochbergin väärän havaitsemisprosentin menetelmää: muunnelmien katsotaan olevan merkittävästi yhteydessä toisiinsa, jos niiden väärien havaitsemisprosentti on alle 5 % ( EWAS:lle) tai 10 % (kandidaattigeenianalyysille).

Ehdokasgeenin valinta:

Farmakogeneettisten varianttien oletetaan vaikuttavan kemoterapeuttisten lääkkeiden kinetiikkaan ja dynamiikkaan hoitoprotokollassa (pääasiassa PharmGKB:lta). Myös muut farmakogeenit, joilla voi olla vaikutusta toksisuuksien patofysiologiaan vaikuttaviin fysiologisiin toimintoihin, sisällytettäisiin. Pieni alleelitaajuus yli 15 %, toiminnallisuus varianttien suodatuksen kriteerinä analyysia varten toteutettaisiin. Luettelo mahdollisista ehdokkaista on liitteessä "Germline_Genes.txt".

Ehdokasgeenin valinta somaattisten varianttien testaamiseen: Ehdokasgeenien sarja koottiin laajan kirjallisuuskatsauksen jälkeen. Nämä geenit valittiin, koska: i) ne on raportoitu yksittäisissä assosiaatiotutkimuksissa; ii) osallistua steroidihoitojen ja muiden kemoterapeuttisten aineiden farmakodynaamisiin reitteihin; iii) ovat keskeisiä toimijoita taudin patogeneesissä tai taudin hallinnan immunologisissa reiteissä; iv) osallistua kemoterapian ja säteilyn aiheuttamien vaurioiden korjaamiseen; v) olivat ylös- tai alaspäin säädeltyjä lymfoblastoidisoluissa, jotka olivat herkkiä tai resistenttejä prednisolonille, yhteistyökumppanimme ja mentorimme prof. Maja Krajinovicin laboratoriossa tehdyissä kokeissa; vi) voidaan saada steroideihin, kemoterapiaan ja muihin tukihoitoihin spesifisen Ingenuity Pathway Analysis® -analyysin avulla. Vain näiden geenien variantit syötetään tilastolliseen analyysiin assosiaatioiden löytämiseksi. Ainutlaatuisia populaatiotietosarjoja Yhdistyneen kuningaskunnan biopankista (alajoukko Intian populaatiosta) käytetään myös tiettyä fenotyyppiä varten joidenkin ehdokkaiden valinnassa. Somaattisten muunnelmien osalta harkittaisiin julkisia tietovarastoja, kuten DepMap- ja TARGET-tietoja. Ehdokasgeenien joukko mahdollistaa siten yhdestä etnisestä alkuperästä leukemian sekvensointitietokannan luomisen sekä sen kliiniset ja seurantatiedot, jotka kaikki on saatu yhdestä tutkimuksesta. Tämä on arvokas resurssi tutkijoille, jotka tutkivat kysymyksiä, jotka liittyvät lasten ALL-hoitoon.

Ehdokkaat somaattiset ja ituradan variantit, jotka havaitaan koko eksomin sekvensoinnilla, validoidaan käyttämällä suoraa Sanger-sekvensointia PCR-monistuksen jälkeen. Kun Sanger-sekvensointi on läsnä suuressa kloonipopulaatiossa, se mahdollistaa mutaatioiden havaitsemisen heterotsygoottisissa tiloissa. Näin ollen alle 25 %:ssa luennoista raportoidut mutaatiot eivät sisälly tähän validointivaiheeseen.

Vaiheen 2 genotyypitys valituille ehdokkaille vaiheen 1 analyysistä:

Vaiheen 2 analyysit sisältävät 400 ituradan DNA-näytteen seulonnan 120 suurimmasta ehdokkaasta, jotka tunnistettiin vaiheen 1 ituradan sekvensointiassosiaatioanalyysissä TRT:n kanssa. Somaattinen DNA-analyysi sisältää 150 näytteen seulonnan vaiheen 1 analyysin 100 parhaan ehdokkaan joukosta. Kustannustehokkaana strategiana voitaisiin käyttää avoimen matriisin menetelmää (ThermoScientific) tai mittatilaustyönä valmistettuja mikrosiruja (Axiom). Suunnittelemme kehittävämme kustannustehokkaan seulontametodologian, joka on helppo ottaa käyttöön tutkittuihin kliinisiin tuloksiin eniten liittyvien varianttien rutiininomaiseen seurantaan, esim. alleelispesifinen PCR tai yksinkertainen koettimeen perustuva alleelierottelumääritys tai korkearesoluutioinen sulamiskäyräanalyysimenetelmä. . Luodut tiedot tallennetaan paikallisesti JIPMERin ja AIIMS:n pysyviin tietovarastoihin, ja ne jaetaan myös Geneven Pediatric Onko-Hematology Research Platformin kanssa. Clinical Pharmacogenomics Implementation Consortium® (CPIC) -ohjauskomitean kanssa allekirjoitetaan sopimus tässä tutkimuksessa tuotetun farmakogeneettisen tiedon käyttämisestä arvioitaessa, mitkä geneettiset testit sopisivat paremmin Intian potilaspopulaatiolle, mikä mahdollistaa populaatiokohtaisten paneelien kehittämisen. Tulevaisuudessa

Lääkepitoisuuksien mittaus plasmassa tai kokoveressä/punasoluissa (valinnainen):

Myös rutiininomaisista terapeuttisista lääkkeiden seurantapalveluista saatuja analyyttisiä tietoja kerätään ja analysoidaan suhteessa geneettisiin variantteihin ja kliinisiin tuloksiin. Plasma- tai kokoverinäytteet kerätään rutiininomaisesti induktion ja ylläpidon aikana, jotta voidaan seurata lääketasoja ja aktiivisuutta käyttämällä ELISA- tai LC-MS/MS-pohjaisia ​​analyyttisiä menetelmiä. Tämän avulla voimme myös arvioida geneettisiä taipumuksia lääkemääristä riippumatta. L-asparaginaasin aktiivisuustaso mitataan (käyttäen ELISAa) plasmasta, joka on kerätty päivänä 3 ensimmäisen infuusion jälkeen. 6-merkaptopuriinista kerätään kokoverinäytteet kahdeksan viikon ylläpitohoidon aikana (eli päivien 49 ja 56 välillä), ja 6-merkaptopuriinin, 6-tioguaniinin ja 6-metyylimerkaptopuriinin tasot mitataan punasoluista. Metotreksaatti-induktiohoidon aikana kokoverinäytteet otetaan 48 tunnin kuluttua infuusion päättymisestä. Metotreksaattiylläpitohoidon aikana kerätään näytteitä viikolla 7 ja sen metaboliitit analysoidaan. Vinkristiiniä varten induktion aikana näytteet kerättiin 24 tuntia infuusion päättymisen jälkeen.

Plasmaproteiinimarkkerianalyysi ja biologisen materiaalin varasto tulevia tutkimuksia varten:

Tätä osaa ei ole suunniteltu tapahtuvan nykyisen tutkimusapurahahakemuksen yhteydessä, mutta näytepankkitoiminta suoritetaan kuitenkin. Tulevassa erillisessä hankkeessa tai jatkona meneillään olevalle tutkimusprojektille Proximity Extension Assay (PEA), jonka on kehittänyt Olink Proteomics AB (kehrätty Uppsalan yliopistosta, Ruotsi) käytetään kvantifioimaan samanaikaisesti 184 onkologiaa, solujen kasvua ja immunologiaa. -liittyvät ihmisen proteiinien biomarkkerit (valitaan alan asiantuntijoiden ja heidän roolinsa patofysiologiassa) perusteella. Tämä määritys vaatii alle 10 µl:n plasma- tai vertanäytteen, ja se voi mitata 92 proteiinin biomarkkerin ja kolmen sisäisen kontrollinäytteen paneelin kerralla. Tämä määritys suoritetaan käyttämällä 96-kuoppaista levyä kullekin paneelille, joka valitaan erikseen, eikä se vaadi pesuvaiheita. Multimarker-pisteiden kyky ennustaa tuloksia tarkasti havaitaan vastaanottimen toimintaominaisuuksien (ROC) käyrien sekä herkkyys- ja spesifisyysanalyysien avulla.