Estudo de associação farmacogenômica em crianças indianas com leucemia linfoblástica aguda (MPGx-INDALL)

Objetivos primários:

1. Estudar as associações de variantes germinativas estáticas com toxicidades precoces relacionadas à quimioterapia (toxicidades relacionadas ao tratamento) em crianças com LLA submetidas ao protocolo de tratamento Icicle.
2. Investigar os marcadores genéticos somáticos e germinativos associados à eficácia e toxicidade da resposta glicocorticóide, respectivamente.
3. Biobancar amostras biológicas e dados clínicos para futuras análises de associação, a fim de desenvolver biomarcadores de eficácia e toxicidade do protocolo de tratamento.

Objetivos Secundários:

1. Estudar o impacto da ocorrência de toxicidades precoces na qualidade de vida durante o tratamento ativo da LLA (qualidade de vida física e emocional usando a ferramenta PedsQL).
2. Avaliar associações genéticas (somáticas e germinativas) com sobrevida global, mortalidade sem recaída, sobrevida livre de recaída e sobrevida livre de eventos.

Os resultados clínicos:

Todos os dados serão registrados diretamente em um Formulário de Relato de Caso eletrônico (CRF) ou em formulários iniciais em papel pelo assistente de pesquisa clínica do centro ou gerente de dados com a ajuda da enfermeira pesquisadora e pesquisadora sênior empregada no projeto. O investigador clínico de cada centro verificará, datará e assinará os formulários eletronicamente, com monitoramento planejado de dados entre centros e terceiros. Todos os dados do paciente serão salvos sob um pseudônimo. Os dados clínicos relevantes para os objetivos do estudo serão compartilhados (por exemplo, dados demográficos, classificação da doença, teste de doença residual mínima (MRD), citogenética, detalhes de acompanhamento, dados de toxicidade, dados de sobrevivência, dados de recaída, testes de função hepática, testes precoces relacionados ao tratamento toxicidades). Isso também incluirá qualquer toxicidade relacionada à droga ≥ grau 3 ocorrendo desde o primeiro dia de indução até o meio da terapia de manutenção.

TRTs durante a terapia de manutenção são principalmente toxicidades hematológicas e hepáticas que ocorrem nos primeiros 100 dias após o início do tratamento de manutenção ou continuação, e o que ocorrer primeiro será usado para análise de incidência. As toxicidades serão classificadas usando os Critérios de terminologia comum para eventos adversos (CTCAE-versão 5.0 - https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm#ctc_50. Vários eventos para o mesmo paciente também serão registrados para análise. Os dados sobre MRD, resposta da doença em uma semana (prófase) e resposta da doença ao final da terapia com esteróides serão avaliados em relação às variantes genéticas somáticas.

Outros resultados clínicos a serem avaliados em relação aos marcadores genéticos são a incidência de recaída da doença (ou seja, a duração entre o dia da remissão completa e o dia da ocorrência da recaída), mortalidade sem recaída (morte devido a qualquer causa que não seja uma recidiva da doença) e sobrevida global (OS). Haverá um acompanhamento mínimo de um ano (no entanto, todos os pacientes continuarão a ser acompanhados e serão analisados ​​novamente 5 anos após o tratamento para resultados de sobrevivência) para avaliar resultados como OS e RFS. A EFS é definida como o tempo desde o início do tratamento até a primeira falha de indução, não resposta ou progressão da doença, morte por qualquer causa ou censura na data do último acompanhamento. OS é definido como o tempo desde o início da terapia até a morte por qualquer causa. Os pacientes do Jawaharlal Institute of Post-graduate Medical Education and Research (JIPMER) e All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) responderão a um questionário de qualidade de vida no momento do diagnóstico e por volta do dia 100 (+/- 30 dias) da fase de manutenção (outros pontos de tempo durante a terapia de manutenção seriam avaliados, mas não no âmbito da atual proposta de pesquisa), usando as escalas centrais genéricas do inventário de qualidade de vida pediátrica, PedsQL (https://www.pedsql.org /). O módulo de câncer do questionário pedSQl será implementado se estiver pronto no momento do recrutamento do primeiro paciente, de acordo com as diretrizes do fundo de pesquisa Mapi, que fornece esses questionários após a obtenção da licença (https://eprovide.mapi-trust.org /). Caso contrário, o módulo genérico será implementado. Outros dados, como dados socioeconômicos e do estado nutricional, serão coletados (carregados no portal da web junto com "CRF"), e as recomendações nutricionais implementadas como parte do protocolo de tratamento padrão de rotina serão extraídas e utilizadas no momento da análise se eles têm um impacto como fatores de confusão em qualquer um dos resultados sob investigação

Procedimento de amostragem:

Amostras de saliva no momento do recrutamento, amostra de sangue total (3-5 ml) são coletadas na remissão completa, coletadas em tubos de EDTA e mantidas congeladas a -80°C até a extração. As amostras de medula óssea também serão coletadas em tubos de EDTA e mantidas congeladas a -80°C até a extração, assim como as amostras que sobrarem após o teste de MRD. Amostras de plasma também serão coletadas em tubos de coleta de sangue EDTA, e a separação do plasma será realizada (amostra de 4 ml de sangue total) usando uma centrífuga de balde oscilante girando por 10 minutos a uma velocidade de 1300g de força centrífuga relativa. Alíquotas de 250 µL de plasma serão armazenadas a -80°C em criotubos pré-marcados.

A extração de DNA será realizada em lotes e uma alíquota será compartilhada com a equipe de Genebra para análises de sequenciamento. As concentrações de DNA serão determinadas usando Qubit ou outro método baseado em SYBR Green, e a integridade será medida usando Tapestation, com valores GQN maiores que 7,5 sendo usados ​​para as análises genéticas. Os processos de purificação e quantificação já foram estabelecidos nos centros JIPMER e AIIMS. As alíquotas restantes serão armazenadas em seus respectivos biobancos. Não serão aceitas etiquetas manuscritas; todas as etiquetas serão devidamente impressas com identificação anônima do paciente, tipo de amostra e horário da coleta. Cada centro garantirá o anonimato das amostras antes de enviar as amostras para análises compartilhadas. Duas alíquotas, cada uma com aproximadamente 1,0 µg de DNA em 50 µl 10 mM de Tris (8.0), serão usadas para sequenciamento (germline 70X, somatic 150X) na análise de fase 1 em Genebra e para genotipagem por PCR em tempo real ou genotipagem open array na análise de fase 2 na Índia. Outras alíquotas seriam armazenadas em biobancos nos respectivos centros para futuras investigações.

Análise de variante genética de fase 1 usando sequenciamento de exoma total:

O sequenciamento completo do exoma será realizado na Plataforma de Genômica do Campus Biotech na Universidade de Genebra. i) preparação da biblioteca; (ii) sequenciamento usando um sistema HiSeq4000 com cobertura média de 70X para amostras de DNA germinativo e 150X para amostras de DNA somático (Illumina); (iii) integração e armazenamento de dados brutos no Sistema de Gerenciamento de Informações Laboratoriais (LIMS) na Plataforma de Pesquisa em Onco-Hematologia Pediátrica do Departamento de Pediatria, Ginecologia e Obstetrícia da Universidade de Genebra. Os dados serão compartilhados com o Instituto Suíço de Bioinformática através do LIMS, para entrada extra na análise (as análises serão realizadas principalmente por um pós-doutorando), e com o JIPMER e o AIIMS para futuras investigações.

Análise de dados genéticos:

Para análise de dados genéticos, genomas inteiros serão alinhados com o genoma de referência hg19 usando um alinhador Burrows-Wheeler, duplicatas de PCR serão removidas usando ferramentas PICARD e recalibrações de pontuação de qualidade base serão realizadas usando o Genome Analysis Toolkit (GATK). Arquivos BAM limpos serão usados ​​para criar arquivos empilhados usando a ferramenta SAM. As variantes da linhagem germinativa serão chamadas usando um GATK Haplotype Caller, e as pontuações de qualidade das variantes serão recalibradas com base em conjuntos de dados públicos usando a ferramenta Variant Recalibrate e anotadas usando ANNOVAR. As variantes não leucêmicas serão simplesmente subtraídas das variantes leucêmicas para obter uma lista de variantes específicas leucêmicas. Sequências leucêmicas e não leucêmicas também serão analisadas simultaneamente para detectar mutações usando os métodos heurísticos disponíveis nas ferramentas Varscan e Mu Tect. Variantes que possam surgir devido a erros de sequência serão detectadas pelo algoritmo SAVI. Faremos análises por meio de (i) uma abordagem de gene candidato com variantes/mutações filtradas para os genes selecionados com base em uma hipótese e (ii) análise de associação livre de hipótese, em todo o exoma, cujo foco será nas variantes localizadas em regiões exônicas, variantes sem sentido ou sem sentido com efeito funcional previsto, bem como variações nos locais de splicing. Os efeitos previstos de variantes missense na função da proteína serão avaliados in silico usando SIFT e PolyPhen2 incorporados às ferramentas VEP. A filtragem de variantes será realizada com base nos projetos 1000 Genomes e NHLBI GO Exome Sequencing. O teste exato de Fisher (associação alélica) e o teste Cochran-Armitage para tendências serão implementados no PLINK para procurar associações entre resultados clínicos e variantes genéticas.

A análise de associação para dados quantitativos e binários será analisada usando modelos linearizados gerais em PLINK, com um limite de significância de 0,05 por número de variantes para as abordagens candidata e exoma ampla. Serão feitas análises alternativas com p-valor de 0,05 e ajustes para testes múltiplos serão realizados usando o método da taxa de falsa descoberta de Benjamin-Hochberg: as variantes são consideradas significativamente associadas se tiverem uma taxa de falsa descoberta inferior a 5% ( para EWAS) ou 10% (para análise de genes candidatos).

Seleção de genes candidatos:

Supõe-se que as variantes farmacogenéticas afetam a cinética e a dinâmica dos medicamentos quimioterapêuticos no protocolo de tratamento (principalmente obtido do PharmGKB). Outros farmacogenes que possam ter um impacto nas funções fisiológicas que contribuem para a fisiopatologia das toxicidades também seriam incluídos. Frequência de alelos menores acima de 15%, funcionalidade como critério de filtragem de variantes para análise seria implementada. Uma lista de potenciais candidatos é fornecida no anexo "Germline_Genes.txt".

Seleção de genes candidatos para testes de variantes somáticas: Um conjunto de genes candidatos foi compilado após uma extensa revisão da literatura. Esses genes foram selecionados porque: i) foram relatados por estudos de associação individual; ii) participar das vias farmacodinâmicas das terapias com esteróides e outros quimioterápicos; iii) são atores-chave na patogênese da doença ou nas vias imunológicas de controle da doença; iv) participar da reparação dos danos causados ​​pela quimioterapia e radiação; v) foram regulados para cima ou para baixo em células linfoblastóides sensíveis ou resistentes à prednisolona nos experimentos realizados no laboratório de nosso colaborador e mentor Prof. Maja Krajinovic; vi) pode ser obtido por meio do Ingenuity Pathway Analysis® específico para esteroides, quimioterapia e outras terapias de suporte. Somente variantes desses genes serão inseridas na análise estatística para encontrar associações. Conjuntos de dados populacionais exclusivos do biobanco do Reino Unido (subconjunto da população indiana) também serão utilizados para o fenótipo específico para selecionar alguns dos candidatos. Para variantes somáticas, repositórios de dados públicos, como dados DepMap e TARGET, seriam considerados. O conjunto de genes candidatos permitirá, assim, a criação de um banco de dados de sequenciamento de leucemia de uma única etnia, juntamente com seus dados clínicos e de acompanhamento, todos obtidos em um único estudo. Isso servirá como um recurso valioso para pesquisadores que investigam questões relacionadas ao tratamento de ALL em crianças.

As variantes somáticas e germinativas candidatas detectadas pelo sequenciamento completo do exoma serão validadas usando o sequenciamento direto de Sanger após a amplificação por PCR. Quando presente em uma grande população clonal, o sequenciamento de Sanger permite a detecção de mutações em estados heterozigotos. Portanto, as mutações relatadas em < 25% das leituras não serão incluídas nesta fase de validação.

Genotipagem de fase 2 para candidatos selecionados da análise de fase 1:

As análises da Fase 2 incluirão a triagem de 400 amostras de DNA de linhagem germinativa dos 120 principais candidatos identificados na análise de associação de sequenciamento de linhagem germinativa da fase 1 com TRT. A análise de DNA somático inclui a triagem de 150 amostras dos 100 principais candidatos da análise de fase 1. Uma metodologia open-array (ThermoScientific) ou microarrays customizados (Axiom) podem ser usados ​​como uma estratégia econômica. Planejamos desenvolver uma metodologia de triagem econômica que seja fácil de implementar para monitoramento de rotina das variantes mais associadas aos resultados clínicos investigados, por exemplo, PCR específico de alelo ou ensaios simples de discriminação de alelos baseados em sonda ou métodos de análise de curva de fusão de alta resolução . Os dados gerados serão armazenados localmente nos repositórios de dados permanentes do JIPMER e AIIMS e também serão compartilhados com a Plataforma de Pesquisa em Onco-Hematologia Pediátrica de Genebra. Um acordo será assinado com o comitê diretor do Clinical Pharmacogenomics Implementation Consortium® (CPIC) sobre o uso dos dados farmacogenéticos gerados neste estudo para avaliar quais testes genéticos seriam mais apropriados para a população de pacientes indianos, permitindo assim o desenvolvimento de painéis específicos da população no futuro

Medição dos níveis de droga no plasma ou sangue total/glóbulos vermelhos (opcional):

Os dados analíticos obtidos nos serviços de monitoramento de drogas terapêuticas de rotina também serão coletados e analisados ​​em relação a variantes genéticas e desfechos clínicos. Amostras de plasma ou amostras de sangue total serão coletadas rotineiramente durante a indução e manutenção para monitorar os níveis e a atividade do medicamento usando métodos analíticos baseados em ELISA ou LC-MS/MS. Isso também nos permitirá avaliar as predisposições genéticas independentemente dos níveis de drogas. O nível de atividade da L-asparaginase será medido (usando ELISA) do plasma coletado no dia 3 após a primeira infusão. Para 6-mercaptopurina, amostras de sangue total serão coletadas durante as oito semanas de terapia de manutenção (ou seja, entre os dias 49 e 56), e os níveis de 6-mercaptopurina, 6-tioguanina e 6-metil mercaptopurina serão medidos em hemácias. Durante a terapia de indução com metotrexato, amostras de sangue total serão coletadas 48 horas após o término da infusão. Durante a terapia de manutenção com metotrexato, amostras serão coletadas durante a semana 7 e análises de seus metabólitos. Para a vincristina durante a indução, as amostras foram coletadas 24 horas após o término da infusão.

Análise de marcadores de proteínas plasmáticas e repositório de material biológico para estudos futuros:

Esta parte não está planejada para ocorrer no atual pedido de bolsa de pesquisa, no entanto, o banco de amostras será realizado. Em um futuro projeto separado ou como continuação do atual projeto de pesquisa, o Ensaio de Extensão de Proximidade (PEA) desenvolvido pela Olink Proteomics AB (desenvolvido na Uppsala University, Suécia) será usado para quantificar simultaneamente 184 oncologia, crescimento celular e imunologia biomarcadores de proteína humana relacionados (a serem escolhidos com base na contribuição de especialistas na área e seus papéis na fisiopatologia). Este ensaio requer uma amostra de menos de 10 µl de plasma ou sangue e pode medir um painel de 92 biomarcadores de proteínas e três amostras de controle interno de uma só vez. Este ensaio será realizado usando uma placa de 96 poços para cada painel, selecionados separadamente, e não requer etapas de lavagem. A capacidade da pontuação de múltiplos marcadores de prever com precisão os resultados será detectada usando curvas de características operacionais do receptor (ROC), juntamente com análises de sensibilidade e especificidade.