Pharmacogenomic Association Study bei indischen Kindern mit akuter lymphoblastischer Leukämie (MPGx-INDALL)

Hauptziele:

1. Es sollten die Assoziationen statischer Keimbahnvarianten mit frühen chemotherapiebedingten Toxizitäten (behandlungsbedingte Toxizitäten) bei Kindern mit ALL untersucht werden, die sich dem Icicle-Behandlungsprotokoll unterziehen.
2. Es sollten die somatischen und genetischen Marker der Keimbahn untersucht werden, die mit der Wirksamkeit bzw. Toxizität der Glucocorticoid-Reaktion assoziiert sind.
3. Biobanking biologischer Proben und klinischer Daten für zukünftige Assoziationsanalysen, um Biomarker für die Wirksamkeit und Toxizität des Behandlungsprotokolls zu entwickeln.

Sekundäre Ziele:

1. Untersuchung der Auswirkungen des Auftretens früher Toxizitäten auf die Lebensqualität während einer aktiven ALL-Behandlung (körperliche und emotionale Lebensqualität mit dem PedsQL-Tool).
2. Bewertung der genetischen Assoziationen (somatisch und Keimbahn) mit dem Gesamtüberleben, der Mortalität ohne Rückfall, dem rückfallfreien Überleben und dem ereignisfreien Überleben.

Klinische Ergebnisse:

Alle Daten werden vom klinischen Forschungsassistenten oder Datenmanager des Zentrums mit Hilfe der im Projekt beschäftigten Forschungskrankenschwester und leitenden Forschungsassistenten direkt in ein elektronisches Fallberichtsformular (CRF) oder auf anfängliche papierbasierte Formulare eingetragen. Der klinische Prüfer jedes Zentrums prüft, datiert und unterzeichnet die Formulare elektronisch, mit geplanter zentrumsübergreifender und externer Datenüberwachung. Alle Patientendaten werden unter einem Pseudonym gespeichert. Klinische Daten, die für die Ziele der Studie relevant sind, werden geteilt (z. B. Demografie, Krankheitsklassifikation, Tests auf minimale Resterkrankung (MRD), Zytogenetik, Einzelheiten zur Nachsorge, Toxizitätsdaten, Überlebensdaten, Rückfalldaten, Leberfunktionstests, frühe behandlungsbezogene Daten). Toxizität). Dazu gehört auch jede arzneimittelbedingte Toxizität ≥ Grad 3, die vom ersten Tag der Einleitung bis zur Mitte der Erhaltungstherapie auftritt.

TRTs während der Erhaltungstherapie sind hauptsächlich hämatologische und hepatische Toxizitäten, die innerhalb der ersten 100 Tage nach Beginn der Erhaltungs- oder Fortsetzungsbehandlung auftreten, und je nachdem, was zuerst eintritt, wird für die Inzidenzanalyse verwendet. Toxizitäten werden anhand der Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE-Version 5.0 – https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm#ctc_50. Zur Analyse werden auch mehrere Ereignisse für denselben Patienten aufgezeichnet. Die Daten zur MRD, zum Ansprechen der Krankheit nach einer Woche (Prophase) und zum Ansprechen der Krankheit am Ende der Steroidtherapie werden in Bezug auf somatische genetische Varianten bewertet.

Andere klinische Ergebnisse, die in Bezug auf genetische Marker zu bewerten sind, sind das Auftreten von Krankheitsrückfällen (d. h. die Dauer zwischen dem Tag der vollständigen Remission und dem Tag des Auftretens des Rückfalls), die Mortalität ohne Rückfall (Tod aus einer anderen Ursache als a Rückfall der Krankheit) und Gesamtüberleben (OS). Es wird ein Follow-up von mindestens einem Jahr geben (allerdings würden alle Patienten weiterhin beobachtet und 5 Jahre nach der Behandlung erneut auf Überlebensergebnisse analysiert), um Ergebnisse wie OS und RFS zu bewerten. EFS ist definiert als die Zeit vom Behandlungsbeginn bis zum ersten Induktionsversagen, Nichtansprechen oder Fortschreiten der Krankheit, Tod jeglicher Ursache oder wird zum Datum der letzten Nachsorge zensiert. OS ist definiert als die Zeit vom Therapiebeginn bis zum Tod jeglicher Ursache. Patienten des Jawaharlal Institute of Post-graduate Medical Education and Research (JIPMER) und des All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) beantworten zum Zeitpunkt der Diagnose und etwa am Tag 100 (+/-30 Tage) einen Fragebogen zur Lebensqualität. der Erhaltungsphase (andere Zeitpunkte während der Erhaltungstherapie würden bewertet, fallen aber nicht in den Geltungsbereich des aktuellen Forschungsvorschlags), unter Verwendung der generischen Kernskalen des pädiatrischen Lebensqualitätsinventars, PedsQL (https://www.pedsql.org /). Das Krebsmodul des pedSQl-Fragebogens wird implementiert, wenn es zum Zeitpunkt der Rekrutierung des ersten Patienten gemäß den Richtlinien von Mapi Research Trust bereit ist, der diese Fragebögen nach Erhalt der Lizenz bereitstellt (https://eprovide.mapi-trust.org /). Andernfalls wird ein generisches Modul implementiert. Andere Daten, wie sozioökonomische Daten und Daten zum Ernährungszustand, werden erfasst (auf das Webportal zusammen mit „CRF“ hochgeladen) und die als Teil des routinemäßigen Standardbehandlungsprotokolls implementierten Ernährungsempfehlungen werden extrahiert und zum Zeitpunkt der Verwendung verwendet Analyse, ob sie sich als Confounder auf eines der untersuchten Ergebnisse auswirken

Probenahmeverfahren:

Speichelproben zum Zeitpunkt der Rekrutierung, Vollblutproben (3-5 ml) werden bei vollständiger Remission gesammelt, in EDTA-Röhrchen gesammelt und bis zur Extraktion bei -80 °C gefroren aufbewahrt. Knochenmarkproben werden ebenfalls in EDTA-Röhrchen gesammelt und bis zur Extraktion bei -80 °C eingefroren, ebenso wie Proben, die nach MRD-Tests übrig bleiben. Plasmaproben werden auch in EDTA-Blutentnahmeröhrchen gesammelt, und die Plasmatrennung wird durchgeführt (4 ml Vollblutprobe) unter Verwendung einer Schwenkbecherzentrifuge, die sich 10 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 1300 g relativer Zentrifugalkraft dreht. Aliquots von 250 µl Plasma werden bei -80 °C in vorbeschrifteten Kryoröhrchen gelagert.

Die DNA-Extraktion wird chargenweise durchgeführt, und ein Aliquot wird mit dem Genfer Team für Sequenzierungsanalysen geteilt. DNA-Konzentrationen werden mit Qubit oder einer anderen auf SYBR Green basierenden Methode bestimmt, und die Integrität wird mit Tapestation gemessen, wobei GQN-Werte von mehr als 7,5 für die genetischen Analysen verwendet werden. Sowohl im JIPMER- als auch im AIIMS-Zentrum wurden bereits Aufreinigungs- und Quantifizierungsprozesse etabliert. Verbleibende Aliquots werden in ihren jeweiligen Biobanken aufbewahrt. Es werden keine handschriftlichen Etiketten akzeptiert; Alle Etiketten werden ordnungsgemäß mit einer anonymisierten Patienten-ID, Probenart und Entnahmezeit bedruckt. Jedes Zentrum stellt die Anonymisierung der Proben sicher, bevor es die Proben für gemeinsame Analysen versendet. Zwei Aliquots mit jeweils etwa 1,0 µg DNA in 50 µl 10 mM Tris (8,0) werden für die Sequenzierung (Keimbahn 70X, somatisch 150X) in der Phase-1-Analyse in Genf und für die Echtzeit-PCR-Genotypisierung oder Open-Array-Genotypisierung verwendet in Phase-2-Analyse in Indien. Andere Aliquots würden in Biobanken an den jeweiligen Zentren für zukünftige Untersuchungen aufbewahrt.

Genetische Variantenanalyse der Phase 1 mit Whole-Exome-Sequenzierung:

Die Sequenzierung des gesamten Exoms wird auf der Genomics Platform von Campus Biotech an der Universität Genf durchgeführt. Unter Verwendung von 100 Keimbahn-DNA-Proben und 100 DNA-Proben aus Leukämiezellen (gleiche Patienten) wird die Sequenzierung des gesamten Exoms den folgenden Arbeitsablauf gemäß den Herstellerprotokollen verwenden: ( i) Bibliotheksvorbereitung; (ii) Sequenzierung unter Verwendung eines HiSeq4000-Systems mit einer mittleren Abdeckung von 70X für Keimbahn-DNA-Proben und 150X für somatische DNA-Proben (Illumina); (iii) Rohdatenintegration und -speicherung im Laborinformationsmanagementsystem (LIMS) der Pädiatrischen Onko-Hämatologie-Forschungsplattform der Abteilung für Pädiatrie, Gynäkologie und Geburtshilfe der Universität Genf. Die Daten werden über das LIMS mit dem Schweizerischen Institut für Bioinformatik geteilt, um zusätzlichen Input für die Analyse zu erhalten (Analysen werden hauptsächlich von einem Postdoktoranden durchgeführt), und mit JIPMER und AIIMS für zukünftige Untersuchungen.

Genetische Datenanalyse:

Für die genetische Datenanalyse werden ganze Genome mit dem hg19-Referenzgenom mit einem Burrows-Wheeler-Aligner abgeglichen, PCR-Duplikate werden mit PICARD-Tools entfernt und Neukalibrierungen des Basis-Qualitäts-Scores werden mit dem Genome Analysis Toolkit (GATK) durchgeführt. Gereinigte BAM-Dateien werden verwendet, um Stapeldateien mit dem SAM-Tool zu erstellen. Keimbahnvarianten werden mit einem GATK-Haplotyp-Caller aufgerufen, und Variantenqualitäts-Scores werden basierend auf öffentlichen Datensätzen mit dem Variant Recalibrate-Tool neu kalibriert und mit ANNOVAR kommentiert. Nicht-Leukämie-Varianten werden dann einfach von Leukämie-Varianten subtrahiert, um eine Leukämie-spezifische Variantenliste zu erhalten. Leukämische und nicht-leukämische Sequenzen werden auch gleichzeitig analysiert, um Mutationen unter Verwendung der heuristischen Methoden zu erkennen, die in den Tools Varscan und Mu Tect verfügbar sind. Varianten, die aufgrund von Sequenzfehlern entstehen könnten, werden vom SAVI-Algorithmus erkannt. Wir werden die Analyse über (i) einen Kandidatengenansatz mit gefilterten Varianten/Mutationen zu den ausgewählten Genen basierend auf einer Hypothese und (ii) eine hypothesenfreie, exomweite Assoziationsanalyse durchführen, deren Fokus auf den Varianten liegen wird in exonischen Regionen lokalisiert, Missense- oder Nonsense-Varianten mit vorhergesagter funktioneller Wirkung sowie Variationen in Spleißstellen. Die vorhergesagten Auswirkungen von Missense-Varianten auf die Proteinfunktion werden in silico unter Verwendung von SIFT und PolyPhen2 bewertet, die in VEP-Tools integriert sind. Die Variantenfilterung wird basierend auf den Projekten 1000 Genomes und NHLBI GO Exome Sequencing durchgeführt. Der exakte Fisher-Test (allele Assoziation) und der Cochran-Armitage-Test für Trends werden in PLINK implementiert, um nach Zusammenhängen zwischen klinischen Ergebnissen und genetischen Varianten zu suchen.

Die Assoziationsanalyse für quantitative und binäre Daten wird unter Verwendung allgemeiner linearisierter Modelle in PLINK mit einer Signifikanzschwelle von 0,05 pro Anzahl von Varianten für den Kandidaten und exomweite Ansätze analysiert. Es werden alternative Analysen mit einem p-Wert von 0,05 eingerichtet und Anpassungen für multiples Testen werden unter Verwendung der Benjamin-Hochberg-False-Discovery-Rate-Methode durchgeführt: Varianten gelten als signifikant assoziiert, wenn sie eine False-Discovery-Rate von weniger als 5 % aufweisen ( für EWAS) oder 10 % (für Kandidatengenanalyse).

Kandidatengenauswahl:

Es wird angenommen, dass die pharmakogenetischen Varianten die Kinetik und Dynamik von Chemotherapeutika im Behandlungsprotokoll beeinflussen (hauptsächlich erhalten von PharmGKB). Andere Pharmakogene, die einen Einfluss auf die physiologischen Funktionen haben könnten, die zur Pathophysiologie von Toxizitäten beitragen, würden ebenfalls eingeschlossen. Minor-Allel-Häufigkeit über 15 %, Funktionalität als Kriterium der Variantenfilterung für die Analyse würde implementiert werden. Eine Liste möglicher Kandidaten findet sich im Anhang „Germline_Genes.txt“.

Kandidatengenauswahl für somatische Variantentests: Nach einer umfassenden Literaturrecherche wurde ein Satz von Kandidatengenen zusammengestellt. Diese Gene wurden ausgewählt, weil sie: i) von individuellen Assoziationsstudien berichtet wurden; ii) an den pharmakodynamischen Signalwegen von Steroidtherapien und anderen Chemotherapeutika teilnehmen; iii) Schlüsselakteure bei der Pathogenese von Krankheiten oder den immunologischen Signalwegen der Krankheitskontrolle sind; iv) an der Reparatur von Schäden teilnehmen, die durch Chemotherapie und Bestrahlung verursacht wurden; v) in den Experimenten, die im Labor unserer Mitarbeiterin und Mentorin Prof. Maja Krajinovic durchgeführt wurden, in lymphoblastoiden Zellen hoch- oder herunterreguliert wurden, die gegenüber Prednisolon empfindlich oder resistent waren; vi) können über Ingenuity Pathway Analysis® bezogen werden, die für Steroide, Chemotherapie und andere unterstützende Behandlungstherapien spezifisch sind. Nur Varianten dieser Gene werden in die statistische Analyse eingespeist, um Assoziationen zu finden. Es werden auch einzigartige Populationsdatensätze aus der britischen Biobank (Untergruppe der indischen Population) für einen bestimmten Phänotyp verwendet, um einige der Kandidaten auszuwählen. Für somatische Varianten würden öffentliche Datenspeicher wie DepMap und TARGET-Daten in Betracht gezogen. Der Satz von Kandidatengenen wird somit die Erstellung einer Leukämie-Sequenzierungsdatenbank einer einzelnen ethnischen Zugehörigkeit zusammen mit ihren klinischen und Follow-up-Daten ermöglichen, die alle aus einer einzigen Studie stammen. Dies wird als wertvolle Ressource für Forscher dienen, die Fragen im Zusammenhang mit der ALL-Behandlung bei Kindern untersuchen.

Die Kandidaten für somatische und Keimbahnvarianten, die durch die Sequenzierung des gesamten Exoms nachgewiesen werden, werden anhand der direkten Sanger-Sequenzierung nach der PCR-Amplifikation validiert. Wenn sie in einer großen klonalen Population vorhanden ist, ermöglicht die Sanger-Sequenzierung den Nachweis von Mutationen in heterozygoten Zuständen. Daher werden Mutationen, die in < 25 % der Reads gemeldet werden, nicht in diese Validierungsphase aufgenommen.

Phase-2-Genotypisierung für ausgewählte Kandidaten aus der Phase-1-Analyse:

Die Analysen der Phase 2 umfassen das Screening von 400 Keimbahn-DNA-Proben der 120 besten Kandidaten, die in Phase 1 der Keimbahn-Sequenzierungs-Assoziationsanalyse mit TRT identifiziert wurden. Die somatische DNA-Analyse umfasst das Screening von 150 Proben der 100 besten Kandidaten aus der Phase-1-Analyse. Als kostengünstige Strategie könnten eine Open-Array-Methodik (ThermoScientific) oder maßgeschneiderte Microarrays (Axiom) eingesetzt werden. Wir planen, eine kostengünstige Screening-Methodik zu entwickeln, die einfach zu implementieren ist, um routinemäßig die Varianten zu überwachen, die am stärksten mit den untersuchten klinischen Ergebnissen assoziiert sind, z. B. allelspezifische PCR oder einfache sondenbasierte Alleldiskriminierungsassays oder hochauflösende Schmelzkurvenanalysemethoden . Die generierten Daten werden lokal in den permanenten Datenspeichern von JIPMER und AIIMS gespeichert und auch mit der Pädiatrischen Onko-Hämatologie-Forschungsplattform von Genf geteilt. Mit dem Lenkungsausschuss des Clinical Pharmacogenomics Implementation Consortium® (CPIC) wird eine Vereinbarung über die Verwendung der in dieser Studie generierten pharmakogenetischen Daten unterzeichnet, um zu bewerten, welche Gentests für die indische Patientenpopulation geeigneter wären, wodurch die Entwicklung bevölkerungsspezifischer Panels ermöglicht wird künftig

Messung von Medikamentenspiegeln in Plasma oder Vollblut/Erythrozyten (optional):

Die Analysedaten, die aus routinemäßigen therapeutischen Arzneimittelüberwachungsdiensten stammen, werden ebenfalls gesammelt und in Bezug auf genetische Varianten und klinische Ergebnisse analysiert. Plasmaproben oder Vollblutproben werden während der Induktion und Erhaltung routinemäßig entnommen, um die Arzneimittelspiegel und -aktivität mit ELISA- oder LC-MS/MS-basierten Analysemethoden zu überwachen. Dies wird es uns auch ermöglichen, genetische Prädispositionen unabhängig von Medikamentenspiegeln zu bewerten. Das Aktivitätsniveau von L-Asparaginase wird (unter Verwendung von ELISA) aus Plasma gemessen, das am Tag 3 nach der ersten Infusion entnommen wird. Für 6-Mercaptopurin werden während der achtwöchigen Erhaltungstherapie (d. h. zwischen den Tagen 49 und 56) Vollblutproben entnommen, und die 6-Mercaptopurin-, 6-Thioguanin- und 6-Methylmercaptopurinspiegel werden in RBCs gemessen. Während der Methotrexat-Induktionstherapie werden Vollblutproben 48 Stunden nach Ende der Infusion entnommen. Während der Methotrexat-Erhaltungstherapie werden in Woche 7 Proben entnommen und ihre Metaboliten analysiert. Für Vincristin während der Induktion wurden Proben 24 Stunden nach dem Ende der Infusion gesammelt.

Plasmaprotein-Marker-Analyse und Repositorium für biologisches Material für zukünftige Studien:

Dieser Teil ist im Rahmen des aktuellen Forschungsstipendienantrags nicht vorgesehen, es wird jedoch ein Musterbanking durchgeführt. In einem zukünftigen separaten Projekt oder als Fortsetzung des aktuellen Forschungsprojekts wird der Proximity Extension Assay (PEA), entwickelt von Olink Proteomics AB (aus der Uppsala University, Schweden) entwickelt, zur gleichzeitigen 184 Quantifizierung von Onkologie, Zellwachstum und Immunologie verwendet -bezogene menschliche Protein-Biomarker (zu wählen auf der Grundlage der Beiträge von Experten auf diesem Gebiet und ihrer Rolle in der Pathophysiologie). Dieser Assay erfordert eine Plasma- oder Blutprobe von weniger als 10 µl und kann eine Reihe von 92 Protein-Biomarkern und drei interne Kontrollproben gleichzeitig messen. Dieser Assay wird unter Verwendung einer 96-Well-Platte für jedes Panel durchgeführt, die separat ausgewählt wird, und erfordert keine Waschschritte. Die Fähigkeit des Multimarker-Scores, Ergebnisse genau vorherzusagen, wird anhand von Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurven zusammen mit Sensitivitäts- und Spezifitätsanalysen nachgewiesen.