Farmakogenomisk foreningsstudie i indiske barn med akutt lymfoblastisk leukemi (MPGx-INDALL)

Primære mål:

1. For å studere assosiasjonene til statiske kimlinjevarianter med tidlig kjemoterapirelatert toksisitet (behandlingsrelatert toksisitet) hos barn med ALL som gjennomgår Icicle-behandlingsprotokollen.
2. For å undersøke de somatiske og kimlinjegenetiske markørene assosiert med henholdsvis effekten og toksisiteten til glukokortikoidrespons.
3. Å biobanke biologiske prøver og kliniske data for fremtidige assosiasjonsanalyser for å utvikle biomarkører for behandlingsprotokollens effekt og toksisitet.

Sekundære mål:

1. For å studere virkningen av forekomsten av tidlig toksisitet på livskvalitet under aktiv ALL-behandling (fysisk og emosjonell livskvalitet ved bruk av PedsQL-verktøyet).
2. For å evaluere genetiske assosiasjoner (somatisk og kimlinje) med total overlevelse, ikke-tilbakefallsdødelighet, tilbakefallsfri overlevelse og hendelsesfri overlevelse.

Kliniske resultater:

Alle data vil bli registrert direkte i et elektronisk Case Report Form (CRF) eller på innledende papirbaserte skjemaer av senterets kliniske forskningsassistent eller dataansvarlig ved hjelp av forskningssykepleier og seniorstipendiat ansatt i prosjektet. Hvert senters kliniske etterforsker vil sjekke, datere og signere skjemaene elektronisk, med planlagt inter-senter og tredjeparts dataovervåking. Alle pasientdata vil bli lagret under et pseudonym. Kliniske data som er relevante for studiens mål vil bli delt (f.eks. demografi, sykdomsklassifisering, testing av minimal restsykdom (MRD), cytogenetikk, oppfølgingsdetaljer, toksisitetsdata, overlevelsesdata, tilbakefallsdata, leverfunksjonstester, tidlig behandlingsrelatert toksisiteter). Dette vil også inkludere all legemiddelrelatert toksisitet ≥ grad 3 som forekommer fra den første induksjonsdag til midten av vedlikeholdsbehandlingen.

TRT-er under vedlikeholdsbehandling er hovedsakelig hematologiske og hepatiske toksisiteter som oppstår i løpet av de første 100 dagene etter oppstart av vedlikeholds- eller fortsettelsesbehandling, og det som inntreffer først vil bli brukt til insidensanalyse. Toksisiteter vil bli gradert ved å bruke Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE-versjon 5.0 - https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm#ctc_50. Flere hendelser for samme pasient vil også bli registrert for analyse. Data om MRD, sykdomsrespons ved en uke (profase), og sykdomsrespons ved slutten av steroidbehandling vil bli vurdert i forhold til somatiske genetiske varianter.

Andre kliniske utfall som skal vurderes i forhold til genetiske markører er forekomst av tilbakefall av sykdom (dvs. varigheten mellom dagen for fullstendig remisjon og dagen for tilbakefall), dødelighet uten tilbakefall (død som skyldes andre årsaker enn en tilbakefall av sykdommen), og total overlevelse (OS). Det vil være minimum ett års oppfølging (Men alle pasientene vil fortsette å bli fulgt og vil bli analysert igjen 5 år etter behandling for overlevelsesresultater) for å evaluere utfall som OS og RFS. EFS er definert som tiden fra behandlingsstart til første induksjonssvikt, manglende respons eller progresjon av sykdommen, død av en hvilken som helst årsak, eller er sensurert på datoen for siste oppfølging. OS er definert som tiden fra behandlingsstart til død uansett årsak. Pasienter fra Jawaharlal Institute of Post-graduate Medical Education and Research (JIPMER) og All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) vil svare på et livskvalitetsspørreskjema ved diagnosetidspunktet og rundt dag 100 (+/-30 dager) av vedlikeholdsfasen (andre tidspunkt under vedlikeholdsterapi vil bli evaluert, men ikke under rammen av det nåværende forskningsforslaget), ved å bruke de generiske kjerneskalaene til pediatrisk livskvalitetsinventar, PedsQL (https://www.pedsql.org /). Kreftmodulen til pedSQl-spørreskjemaet vil bli implementert hvis den er klar ved rekruttering av den første pasienten i henhold til retningslinjene fra Mapi Research Trust som leverer disse spørreskjemaene ved å oppnå lisens (https://eprovide.mapi-trust.org /). Ellers vil generisk modul bli implementert. Andre data, som sosioøkonomiske og ernæringsmessige statusdata vil bli samlet inn (lastet opp på nettportalen sammen med "CRF"), og ernæringsanbefalingene implementert som en del av rutinemessig standard behandlingsprotokoll vil bli hentet ut og brukt på tidspunktet for analysere om de har en innvirkning som forstyrrer på noen av resultatene som undersøkes

Prøveprosedyre:

Spyttprøver ved rekrutteringstidspunktet, helblodsprøve (3-5 ml) samles ved fullstendig remisjon, samlet i EDTA-rør vil holde den frosset ved -80°C frem til ekstraksjon. Benmargsprøver vil også bli samlet i EDTA-rør og holdt frosset ved -80 °C frem til ekstraksjon, og det samme vil prøvene som er til overs etter MRD-testing. Plasmaprøver vil også bli samlet i EDTA blodprøverør, og plasmaseparasjon vil bli utført (4 ml fullblodsprøve) ved bruk av en svingende bøttesentrifuge som spinner i 10 minutter med en hastighet på 1300g relativ sentrifugalkraft. Alikvoter på 250 µL plasma vil bli lagret ved -80 °C i forhåndsmerkede kryorør.

DNA-ekstraksjon vil bli utført i batcher, og en alikvot vil bli delt med Genève-teamet for sekvenseringsanalyser. DNA-konsentrasjoner vil bli bestemt ved hjelp av Qubit eller en annen SYBR Green-basert metode, og integritet vil bli målt ved hjelp av Tapestation, med GQN-verdier større enn 7,5 som brukes for de genetiske analysene. Rense- og kvantifiseringsprosesser er allerede etablert både ved JIPMER- og AIIMS-sentrene. Resterende alikvoter vil bli lagret i deres respektive biobanker. Ingen håndskrevne etiketter vil bli akseptert; alle etiketter vil bli behørig trykt med en anonymisert pasient-ID, prøvetype og tidspunkt for innsamling. Hvert senter vil sikre prøveanonymisering før prøvene sendes ut for delte analyser. To alikvoter, hver med omtrent 1,0 µg DNA i 50 µl 10 mM Tris (8,0), vil bli brukt til sekvensering (kimlinje 70X, somatisk 150X) i fase 1-analyse i Genève og for sanntids PCR-genotyping eller open array genotyping i fase 2-analyse i India. Andre alikvoter vil bli lagret i biobanker ved respektive sentre for fremtidige undersøkelser.

Fase 1 genetisk variantanalyse ved bruk av Whole-exome sekvensering:

Heleksomsekvensering vil bli utført på Campus Biotechs Genomics-plattform ved Universitetet i Genève Ved bruk av 100 kimlinje-DNA-prøver og 100 DNA-prøver fra leukemiceller (samme pasienter), vil heleksomsekvensering bruke følgende arbeidsflyt i henhold til produsentens protokoller: ( i) bibliotekforberedelse; (ii) sekvensering ved bruk av et HiSeq4000-system med en gjennomsnittlig dekning på 70X for kimlinje-DNA-prøver og 150X for somatiske DNA-prøver (Illumina); (iii) integrasjon og lagring av rådata i Laboratory Information Management System (LIMS) ved Pediatric Onco-Hematology Research Platform ved Universitetet i Genèves avdeling for pediatri, gynekologi og obstetrikk. Data vil bli delt med Swiss Institute of Bioinformatics via LIMS, for ekstra input til analysen (analysene vil hovedsakelig bli utført av en postdoktor), og med JIPMER og AIIMS for fremtidige undersøkelser.

Genetisk dataanalyse:

For genetisk dataanalyse vil hele genomer bli justert med hg19-referansegenomet ved hjelp av en Burrows-Wheeler aligner, PCR-duplikater vil bli fjernet ved hjelp av PICARD-verktøy, og baserekalibreringer av kvalitetspoeng vil bli utført ved bruk av Genome Analysis Toolkit (GATK). Rensede BAM-filer vil bli brukt til å lage pile-up-filer ved hjelp av SAM-verktøyet. Germline-varianter vil bli kalt ved hjelp av en GATK Haplotype Caller, og variantkvalitetspoeng vil bli rekalibrert basert på offentlige datasett ved hjelp av Variant Recalibrate-verktøyet og kommentert ved hjelp av ANNOVAR. Ikke-leukemiske varianter vil da ganske enkelt trekkes fra leukemivarianter for å få en leukemispesifikk variantliste. Leukemiske og ikke-leukemiske sekvenser vil også bli analysert samtidig for å oppdage mutasjoner ved å bruke de heuristiske metodene som er tilgjengelige i Varscan- og Mu Tect-verktøyene. Varianter som kan oppstå på grunn av sekvensfeil vil bli oppdaget av SAVI-algoritmen. Vi vil utføre analyse via (i) en kandidatgentilnærming med filtrerte varianter/mutasjoner til de utvalgte genene basert på en hypotese, og (ii) hypotesefri, eksomomfattende assosiasjonsanalyse, hvor fokuset vil være på variantene lokalisert i eksoniske områder, missense- eller nonsensvarianter med spådd funksjonell effekt, samt variasjoner i spleisesteder. De forutsagte effektene av missense-varianter på proteinfunksjon vil bli vurdert i silico ved bruk av SIFT og PolyPhen2 inkorporert i VEP-verktøy. Variantfiltrering vil bli utført basert på 1000 Genomes og NHLBI GO Exome Sequencing-prosjektene. Fishers eksakte test (allelisk assosiasjon) og Cochran-Armitage-testen for trender vil bli implementert i PLINK for å søke etter assosiasjoner mellom kliniske utfall og genetiske varianter.

Assosiasjonsanalyse for kvantitative og binære data vil bli analysert ved bruk av generelle lineariserte modeller i PLINK, med en signifikansgrense på 0,05 per antall varianter for kandidat- og eksomomfattende tilnærminger. Alternative analyser med en p-verdi på 0,05 vil bli satt opp, og justeringer for flere tester vil bli utført ved bruk av Benjamin-Hochbergs falske oppdagelsesrate: varianter anses som signifikant assosiert dersom de har en falsk oppdagelsesrate lavere enn 5 % ( for EWAS) eller 10 % (for kandidatgenanalyse).

Kandidatgenvalg:

De farmakogenetiske variantene antas å påvirke kinetikken og dynamikken til kjemoterapeutiske legemidler i behandlingsprotokollen (hovedsakelig hentet fra PharmGKB). Andre farmakogener som kan ha en innvirkning på de fysiologiske funksjonene som bidrar til patofysiologien til toksisiteter vil også bli inkludert. Mindre allelfrekvens over 15 %, funksjonalitet som et kriterium for variantfiltrering for analyse vil bli implementert. En liste over potensielle kandidater er gitt i vedlegg "Germline_Genes.txt".

Kandidat-genvalg for somatisk varianttesting: Et sett med kandidatgener ble satt sammen etter en omfattende litteraturgjennomgang. Disse genene ble valgt fordi de: i) ble rapportert av individuelle assosiasjonsstudier; ii) delta i de farmakodynamiske veiene til steroidterapier og andre kjemoterapeutiske midler; iii) er nøkkelaktører i sykdomspatogenese eller immunologiske veier for sykdomskontroll; iv) delta i reparasjon av skader forårsaket av kjemoterapi og stråling; v) ble opp- eller nedregulert i lymfoblastoide celler sensitive eller resistente mot prednisolon i eksperimentene utført i vår samarbeidspartner og mentor Prof. Maja Krajinovics laboratorium; vi) kan fås via Ingenuity Pathway Analysis® spesifikk for steroider, kjemoterapi og andre støttende behandlinger. Bare varianter av disse genene vil bli matet inn i den statistiske analysen for å finne assosiasjoner. Unike populasjonsdatasett fra britisk biobank (undergruppe indisk befolkning) vil også bli brukt for spesifikke fenotyper for å velge noen av kandidatene. For somatiske varianter vil offentlige datalager som DepMap og TARGET-data bli vurdert. Settet med kandidatgener vil dermed muliggjøre opprettelsen av en leukemi-sekvenseringsdatabase for en enkelt etnisitet, sammen med dens kliniske og oppfølgingsdata, alt hentet fra en enkelt studie. Dette vil tjene som en verdifull ressurs for forskere som undersøker spørsmål knyttet til ALL behandling hos barn.

Somatiske kandidat- og kimlinjevarianter oppdaget ved hel eksomsekvensering vil bli validert ved bruk av direkte Sanger-sekvensering etter PCR-amplifisering. Når det er tilstede i en større klonal populasjon, muliggjør Sanger-sekvensering påvisning av mutasjoner i heterozygote tilstander. Derfor vil mutasjoner rapportert i < 25 % av avlesningene ikke inkluderes i denne valideringsfasen.

Fase 2 genotyping for utvalgte kandidater fra fase 1 analysen:

Fase 2-analyser vil inkludere screening av 400 kimlinje-DNA-prøver fra de 120 beste kandidatene identifisert i fase1s kimlinjesekvenseringsassosiasjonsanalyse med TRT. Somatisk DNA-analyse inkluderer screening av 150 prøver fra de 100 beste kandidatene fra fase 1-analyse. En åpen array-metodikk (ThermoScientific) eller skreddersydde mikromatriser (Axiom) kan brukes som en kostnadseffektiv strategi. Vi planlegger å utvikle en kostnadseffektiv screeningmetodikk som er enkel å implementere for rutineovervåking av variantene som er mest assosiert med de kliniske resultatene som er undersøkt, for eksempel allelspesifikk PCR eller enkle probebaserte alleldiskrimineringsanalyser eller høyoppløselige smeltekurveanalysemetoder . Data generert vil bli lagret lokalt i JIPMER og AIIMS sine permanente datalagre og vil også bli delt med Genèves Pediatric Onco-Hematology Research Platform. Det vil bli signert en avtale med Clinical Pharmacogenomics Implementation Consortium®(CPIC) styringskomité om bruk av farmakogenetiske data generert i denne studien for å vurdere hvilke genetiske tester som vil være mer passende for den indiske pasientpopulasjonen, og dermed muliggjøre utviklingen av populasjonsspesifikke paneler i fremtiden

Måling av medikamentnivåer i plasma eller fullblod/røde blodceller (valgfritt):

De analytiske dataene innhentet fra rutinemessige terapeutiske legemiddelovervåkingstjenester vil også bli samlet inn og analysert i forhold til genetiske varianter og kliniske utfall. Plasmaprøver eller helblodsprøver vil rutinemessig samles inn under induksjon og vedlikehold for å overvåke medikamentnivåer og aktivitet ved bruk av ELISA eller LC-MS/MS-baserte analysemetoder. Dette vil også tillate oss å vurdere genetiske predisposisjoner uavhengig av medikamentnivåer. Aktivitetsnivået til L-asparaginase vil bli målt (ved hjelp av ELISA) fra plasma samlet på dag 3 etter første infusjon. For 6-merkaptopurin vil det bli samlet inn fullblodsprøver i løpet av de åtte ukene med vedlikeholdsbehandling (dvs. mellom dag 49 og 56), og nivåer av 6-merkaptopurin, 6-tioguanin og 6-metylmerkaptopurin vil bli målt i RBC. Under induksjonsbehandling med metotreksat vil det bli tatt fullblodsprøver 48 timer etter avsluttet infusjon. Under vedlikeholdsbehandling med metotreksat vil prøver tas i uke 7, og metabolitter analyseres. For vinkristin under induksjon ble prøver tatt 24 timer etter slutten av infusjonen.

Plasmaproteinmarkøranalyse og biologisk materialelager for fremtidige studier:

Denne delen er ikke planlagt å finne sted under gjeldende forskningsstipend, men det vil bli utført prøvebanking. I et fremtidig separat prosjekt eller som fortsettelse av det nåværende forskningsprosjektet, vil Proximity Extension Assay (PEA) utviklet av Olink Proteomics AB (spunnet ut av Uppsala Universitet, Sverige) brukes til å samtidig kvantifisere 184 onkologi, cellevekst og immunologi -relaterte humane proteinbiomarkører (velges basert på innspill fra eksperter på området og deres roller i patofysiologien). Denne analysen krever en prøve på mindre enn 10 µL plasma eller blod og kan måle et panel med 92 proteinbiomarkører og tre interne kontrollprøver samtidig. Denne analysen vil bli utført med en 96-brønns plate for hvert panel, valgt separat, og det krever ingen vasketrinn. Multimarkørskårens evne til nøyaktig å forutsi utfall vil bli oppdaget ved hjelp av mottakeroperasjonskarakteristikk (ROC) kurver, sammen med sensitivitets- og spesifisitetsanalyser.