PGT-A を受けている非男性因子患者に対する ICSI と人工授精を比較した前向きランダム化試験

卵細胞質内精子注入法 (ICSI) は、体外受精 (IVF) 中に実行される手順で、単一の精子が卵母細胞に直接注入されます。 この手順は、実行可能な精子の数が非常に少ないため、男性因子不妊のために開発されました。 受精率は、従来の授精に匹敵する約 60 ～ 70% であることが注目されています。 その使用は拡大し、現在では異数性の着床前遺伝子検査 (PGT-A) が胚盤胞で行われる IVF サイクルに推奨されています。 PGT-A を使用すると、正倍数体の胚を選択して移植することができ、最終的に着床率が向上し、継続的な妊娠率が上昇し、流産の発生率が低下します。 すべての PGT-A サイクルに ICSI を利用するという推奨事項は、当初、遺伝子検査にポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を使用する際に、単精受精を確実にし、卵母細胞の透明帯に付着した追加の精子からの汚染を最小限に抑えることに基づいていました。 ただし、これは、現在使用されており、はるかに高解像度の分析を可能にする新しい次世代シーケンシング分子技術ではあまり問題になりません。

ICSI は刷り込み障害や先天性欠損症のリスクをわずかに増加させ、体外受精の費用を大幅に増加させる可能性があることが示唆されています。 減数分裂 II は卵母細胞の受精中に発生するため、減数分裂装置の破壊は染色体分裂のエラーにつながる可能性があります。 ICSI 手順が通常の減数分裂プロセスを妨害し、異数性胚盤胞の割合が高くなる可能性があるという仮説を立てています。

私たちの研究では、Texas Fertility Center で PGT-A による IVF を受けている非男性因子不妊症の患者を、従来の人工授精または ICSI にランダムに割り当てます。 回収後に少なくとも10個の卵母細胞を持つ18〜39歳の女性が含まれます。 最初の精液分析では、1,600 万個/mL 以上の精子、42% の運動精子、1,640 万個の総運動精子、30% の漸進的運動性、および 4% の正常な形態 (WHO 第 6 版で定義) 以上が必要です。 患者は、次のいずれかのために除外されます：以前のIVFサイクルからの受精失敗または複数の着床失敗。精子濃度が 1,600 万精子/mL 未満、運動性が 42% 未満、総運動数が 1,640 万未満、進行性運動性が 30% 未満、および正常な形態が 4% 未満であると定義される男性因子不妊症。 39歳以上の女性パートナー;回収後の卵母細胞が 9 個以下。単一遺伝子疾患の着床前遺伝子検査による単一遺伝子分析を必要とするカップル (PGT-M); PGT-A 以外の理由による ICSI。

女性パートナーは、患者の年齢、病歴、および卵巣予備能に基づいて各患者の医師が選択したプロトコルで、制御された卵巣刺激を受けます。 組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）（Ｇｏｎａｌ ＦまたはＦｏｌｌｉｓｔｉｍ）およびヒト更年期ゴナドトロピン（Ｍｅｎｏｐｕｒ）が刺激のために使用される。 性腺刺激ホルモン放出ホルモン (GnRH) アゴニスト (Lupron) またはアンタゴニスト (Cetrotide または Ganirelix) は、経口避妊薬 (OCP) の有無にかかわらず、またはエストラジオール プライミングと共に、排卵の抑制に使用されます。 患者は、超音波を利用して卵胞の成長と血中エストラジオールレベルを測定し、それに応じて投薬と投薬を調整して、1〜3日ごとに監視されます。 卵母細胞の成熟は、ゴナドトロピン放出ホルモン (GnRH) アゴニスト (Lupron) および/またはヒト絨毛性ゴナドトロピン (Novarel または Pregnyl) でトリガーされます。 当センターの標準プロトコルに従って、トリガーから36時間後に採卵が行われます。

卵母細胞は、0.5% ヒト血清アルブミン (HSA) を加えた多目的処理培地 (MHM) で洗浄します。 余分な卵丘細胞と血液がトリミングされます。 卵母細胞は、アーバイン サイエンティフィック連続細胞培養完全培地を含むディッシュに移され、ディッシュあたり 2 つの卵母細胞が含まれます。 その後、皿はインキュベーターに移されます。

ICSIに指定された卵母細胞は、すぐにヒアルロニダーゼにさらされ、卵丘と冠状細胞を取り除きます。 発生学者は、倒立顕微鏡下で成熟状態を評価します。 ICSI は、回収の 4 時間後にすべての成熟中期 II 卵母細胞に対して実施されます。 注入された卵母細胞は、新鮮な培養皿に置かれ、インキュベーターに戻されます。

従来の授精用に指定された卵母細胞の場合、採卵後 4 ～ 6 時間で授精が行われます。 精子は新鮮な標本として収集され、Irvine Scientific Continuous Single Culture-NX で洗浄されます。 精子の濃度と運動性は、WHO 第 6 版の基準に従って、洗浄の前後に評価されます。 精子は、100 マイクロリットルのドロップあたり 200,000 個の精子の濃度を達成するように準備されます。 準備された精子の 6 滴が各皿に追加されます。

ICSIまたは従来の授精（1日目）の翌朝、受精について卵母細胞を検査します。 2 つの前核 (2PN) を持つ受精卵は、5、6、および 7 日目に再度評価するためにグループ培養に保持されます。 内部細胞塊 (ICM) と栄養外胚葉には、それぞれ、Good (G)、Fair (F)、または Poor (P) のグレードが与えられます。 グレードGまたはFの胚盤胞は、栄養外胚葉生検とその後のガラス化を受けます。 栄養外胚葉生検は、標準的なプロトコルを使用して実行されます: 内部細胞塊の反対側の孵化栄養膜細胞は、生検ピペットに静かに吸引されます。 SaturnActive レーザーを使用して、3 ～ 5 個の細胞を分離します。 生検細胞は、PGT-Aセンターのプロトコルに従って準備され、PCRチューブにロードされ、テストセンターへの輸送まで摂氏-20度で保存されます。

次世代シーケンシングは、PGT テスト センター (Ovation Genetics、Cooper Genomics、Natera、RGI、または Genomic Prediction) でサンプルを分析するために使用されます。 倍数性の状態を診断するために、コピー数の変動が使用されます。 倍数性は、正常な染色体数として定義されます。 異数性は異常な数の染色体として定義されます。 モザイク現象は 30 ～ 70% のモザイク現象と定義され、30% 未満のモザイク現象は正数性と見なされ、70% を超えるモザイク現象は異数性と見なされます。 PGT-Aの結果は、正倍数体、異数体、モザイク、および結果のない胚の割合について分析されます。