Prospektivt, randomiseret forsøg, der sammenligner ICSI med insemination for ikke-mandlige faktorpatienter, der gennemgår PGT-A

Intracytoplasmatisk sperminjektion (ICSI) er en procedure, der udføres under in vitro fertilisering (IVF), hvor en enkelt sperm injiceres direkte i en oocyt. Denne procedure blev udviklet til mandlig faktor infertilitet på grund af dens krav om et meget lille antal levedygtige sædceller. Befrugtningsraterne er blevet noteret til at være ca. 60-70%, sammenlignet med traditionel insemination. Dens anvendelse er udvidet og anbefales nu til IVF-cyklusser, hvor præimplantations genetisk testning for aneuploidier (PGT-A) udføres på blastocyster. Med PGT-A kan euploide embryoner udvælges til overførsel, hvilket i sidste ende øger implantationshastigheden, øger antallet af igangværende graviditeter og reducerer forekomsten af ​​abort. Anbefalingen om at bruge ICSI til alle PGT-A-cyklusser var oprindeligt baseret på at sikre monospermisk befrugtning og minimere kontaminering fra yderligere sperm knyttet til oocyttens zona pellucida under brugen af ​​polymerasekædereaktion (PCR) til genetisk testning. Dette er dog mindre problematisk med nyere næste generations sekventeringsmolekylære teknikker, som nu bruges og muliggør analyse med meget højere opløsning.

Det er blevet foreslået, at ICSI kan øge risikoen for prægningsforstyrrelser og fødselsdefekter en smule og øger omkostningerne ved IVF betydeligt. Meiose II opstår under oocytbefrugtning, og som sådan kan enhver forstyrrelse af meioseapparatet potentielt føre til fejl i kromosomdelingen. Vi antager, at ICSI-proceduren kan forstyrre den normale meioseproces og føre til en højere frekvens af aneuploide blastocyster.

Vores undersøgelse vil tilfældigt tildele patienter med ikke-mandlig faktor infertilitet, der gennemgår IVF med PGT-A på Texas Fertility Center, til enten konventionel insemination eller ICSI. Kvinder i alderen 18-39 år med mindst 10 oocytter efter udtagning vil blive inkluderet. Indledende sædanalyse skal have mere end eller lig med 16 millioner sædceller/ml, 42 % bevægelige sædceller, 16,4 millioner samlede bevægelige sædceller, 30 % progressiv motilitet og 4 % normal morfologi (som defineret af WHO 6. udgave). Patienter vil blive udelukket for et af følgende: enhver befrugtningsfejl eller mere end én implantationsfejl fra tidligere IVF-cyklusser; mandlig faktor-infertilitet som defineret ved spermkoncentration mindre end 16 millioner sperm/ml, motilitet mindre end 42 %, totalt antal bevægelige mindre end 16,4 millioner, progressiv motilitet mindre end 30 % og normal morfologi mindre end 4 %; kvindelig partner over 39 år; 9 eller færre oocytter efter udtagning; par, der kræver enkelt genanalyse ved præimplantations genetisk testning for monogene lidelser (PGT-M); ICSI af enhver anden grund end PGT-A.

Den kvindelige partner vil gennemgå kontrolleret ovariestimulering med en protokol valgt af hver patients læge baseret på patientens alder, historie og ovariereserve. Rekombinant follikelstimulerende hormon (FSH) (Gonal F eller Follistim) og humant menopausalt gonadotropin (Menopur) vil blive brugt til stimulering. Gonadotropin-releasing hormon (GnRH) agonist (Lupron) eller antagonist (Cetrotide eller Ganirelix) med eller uden orale p-piller (OCP'er) eller med estradiol priming vil blive brugt til undertrykkelse af ægløsning. Patienten vil blive overvåget hver 1-3 dag ved hjælp af ultralyd til at måle follikulær vækst samt blodestradiolniveauer, med medicin og dosering justeret i overensstemmelse hermed. Oocytmodning vil blive udløst med gonadotropin-releasing hormon (GnRH) agonist (Lupron) og/eller humant choriongonadotropin (Novarel eller Pregnyl). Oocytudvinding vil ske 36 timer efter trigger i henhold til standardprotokoller på vores center.

Oocytter vil blive vasket med multipurpose handling medium (MHM) plus 0,5 % humant serumalbumin (HSA). Overskydende cumulusceller og blod vil blive trimmet. Oocytter vil blive overført til en skål indeholdende Irvine Scientific Continuous Cell Culture Complete Medium med to oocytter pr. skål. Skålen vil derefter blive overført til inkubatoren.

Oocytter, der er udpeget til ICSI, vil straks blive udsat for hyaluronidase for at fjerne cumulus- og koronale celler. Embryologer vil vurdere modningsstatus under omvendt mikroskopi. ICSI vil blive udført på alle modne metafase II oocytter 4 timer efter udtagning. Injicerede oocytter vil derefter blive placeret i en frisk dyrkningsskål og returneret til inkubatoren.

For oocytter, der er udpeget til konventionel insemination, vil insemination ske 4-6 timer efter udtagning. Sperm vil blive indsamlet som en frisk prøve og vasket med Irvine Scientific Continuous Single Culture-NX. Spermkoncentration og motilitet vil blive vurderet før og efter vask i henhold til WHO 6. udgaves kriterier. Sperm vil blive forberedt til at opnå en koncentration på 200.000 sæd pr. 100 mikroliter dråbe. 6 dråber tilberedt sperm vil blive tilføjet til hver ret.

Den følgende morgen efter ICSI eller konventionel insemination (dag 1) vil oocytter blive undersøgt for befrugtning. Zygoter med to pronuclei (2PN) vil blive holdt i gruppekultur for at blive vurderet igen på dag 5, 6 og 7. Embryoer, der når blastocyststadiet, vil blive morfologisk klassificeret af vores embryologer. Den indre cellemasse (ICM) og trophectoderm får hver karakteren God (G), Fair (F) eller Dårlig (P). Blastocyster med grad G eller F vil gennemgå trophectoderm biopsi og efterfølgende forglasning. Trophectoderm-biopsi vil blive udført ved hjælp af en standardprotokol: Udklækkede trofoblastceller modsat den indre cellemasse vil forsigtigt aspireres ind i biopsipipetten. SaturnActive laseren vil blive brugt til at adskille 3-5 celler. Biopsierede celler vil blive klargjort og indlæst i PCR-rør i henhold til PGT-A-centerets protokoller og opbevaret ved -20 grader Celsius indtil transport til testcentret.

Next Generation Sequencing vil blive brugt til at analysere prøver på et PGT-testcenter (Ovation Genetics, Cooper Genomics, Natera, RGI eller Genomic Prediction). Variationer af kopinummer vil blive brugt til at diagnosticere ploidistatus. Euploidi vil blive defineret som et normalt antal kromosomer. Aneuploidi vil blive defineret som et unormalt antal kromosomer. Mosaicisme vil blive defineret som 30-70% mosaicisme, hvorimod mindre end 30% mosaicisme vil blive betragtet som euploidi, og mere end 70% mosaicisme vil blive betragtet som aneuploidi. PGT-A-resultater vil blive analyseret for procentdel af euploide, aneuploide, mosaik- og ingen-resultat embryoner.