PGT-A를 받는 비남성 요인 환자에 대한 수정과 ICSI를 비교하는 전향적 무작위 시험

세포질 내 정자 주입(ICSI)은 단일 정자를 난자에 직접 주입하는 체외 수정(IVF) 중에 수행되는 절차입니다. 이 절차는 매우 적은 수의 생존 가능한 정자가 필요하기 때문에 남성 요인 불임에 대해 개발되었습니다. 수정률은 약 60~70%로 전통적인 수정과 비슷합니다. 이의 사용이 확대되었으며 이제 배반포에서 이수성(PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사가 수행되는 IVF 주기에 권장됩니다. PGT-A를 사용하면 정배수체 배아를 선택하여 이식하여 궁극적으로 착상률을 높이고 지속적인 임신률을 높이고 유산 발생률을 줄일 수 있습니다. 모든 PGT-A 주기에 대해 ICSI를 활용하라는 권장 사항은 초기에 단정자 수정을 보장하고 유전자 검사를 위해 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하는 동안 난모세포의 투명대에 부착된 추가 정자로 인한 오염을 최소화하는 것을 기반으로 했습니다. 그러나 이것은 현재 사용되고 훨씬 더 높은 분해능 분석을 가능하게 하는 새로운 차세대 시퀀싱 분자 기술에 대한 우려가 적습니다.

ICSI는 각인 장애 및 선천적 결함의 위험을 약간 증가시킬 수 있으며 IVF 비용을 크게 증가시킬 수 있다고 제안되었습니다. 감수분열 II는 난자 수정 중에 발생하며, 이와 같이 감수분열 기구의 모든 파괴는 잠재적으로 염색체 분열의 오류로 이어질 수 있습니다. 우리는 ICSI 절차가 정상적인 감수 분열 과정을 방해하고 이수성 배반포의 비율을 높일 수 있다고 가정합니다.

우리의 연구는 Texas Fertility Center에서 PGT-A로 IVF를 받는 비남성 요인 불임 환자를 기존의 수정 또는 ICSI에 무작위로 할당합니다. 회수 후 적어도 10개의 난모세포가 있는 18-39세의 여성이 포함됩니다. 초기 정액 분석은 1600만 정자/mL, 42% 운동성 정자, 1640만 총 운동성 정자, 30% 진행성 운동성 및 4% 정상 형태(WHO 6판에서 정의) 이상이어야 합니다. 환자는 다음 중 하나에 대해 제외됩니다: 수정 실패 또는 이전 IVF 주기에서 한 번 이상의 이식 실패; 1600만 정자/mL 미만의 정자 농도, 42% 미만의 운동성, 1640만 미만의 총 운동성 수, 30% 미만의 진행성 운동성 및 4% 미만의 정상 형태로 정의되는 남성 요인 불임; 39세 이상의 여성 파트너; 회수 후 9개 이하의 난모세포; 단일 유전자 장애(PGT-M)에 대한 착상 전 유전자 검사에 의한 단일 유전자 분석이 필요한 부부; PGT-A 이외의 이유로 ICSI.

여성 파트너는 환자의 나이, 병력 및 난소 예비력을 기준으로 각 환자의 의사가 선택한 프로토콜로 통제된 난소 자극을 받게 됩니다. 재조합 난포자극호르몬(FSH)(Gonal F 또는 Follistim) 및 인간 갱년기 성선자극호르몬(Menopur)이 자극에 사용됩니다. 생식선자극호르몬 방출 호르몬(GnRH) 작용제(Lupron) 또는 길항제(Cetrotide 또는 Ganirelix)는 경구 피임약(OCP)의 유무에 관계없이 또는 에스트라디올 프라이밍과 함께 배란 억제에 사용됩니다. 환자는 초음파를 사용하여 1~3일마다 모니터링하여 난포 성장과 혈중 에스트라디올 수치를 측정하고 그에 따라 약물과 용량을 조정합니다. 난자 성숙은 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH) 작용제(Lupron) 및/또는 인간 융모막 성선 자극 호르몬(Novarel 또는 Pregnyl)으로 유발됩니다. 난모세포 검색은 우리 센터의 표준 프로토콜에 따라 트리거 후 36시간 후에 발생합니다.

난모세포는 다목적 처리 배지(MHM)와 0.5% 인간 혈청 알부민(HSA)으로 세척됩니다. 과도한 적운 세포와 혈액이 잘립니다. 난모세포는 접시당 2개의 난모세포가 있는 Irvine Scientific 연속 세포 배양 완전 배지가 포함된 접시로 옮겨집니다. 그러면 접시가 인큐베이터로 옮겨집니다.

ICSI로 지정된 난모세포는 히알루로니다아제에 즉시 노출되어 난구와 관상 세포를 제거합니다. 배아학자는 도립 현미경으로 성숙 상태를 평가합니다. ICSI는 회수 4시간 후 모든 성숙한 중기 II 난모세포에서 수행됩니다. 주입된 난모세포는 신선한 배양 접시에 배치되고 인큐베이터로 반환됩니다.

일반 수정으로 지정된 난모세포의 경우 수정은 채취 후 4~6시간 후에 이루어집니다. 정자는 신선한 표본으로 수집되어 Irvine Scientific Continuous Single Culture-NX로 세척됩니다. 정자 농도 및 운동성은 WHO 6판 기준에 따라 세척 전후에 평가됩니다. 정자는 100마이크로리터 방울당 200,000개의 정자 농도를 달성하도록 준비됩니다. 준비된 정자 6방울을 각 접시에 추가합니다.

ICSI 또는 일반 수정(1일) 후 다음날 아침, 난모세포의 수정 여부를 검사합니다. 2개의 전핵(2PN)을 가진 접합체는 5일, 6일 및 7일에 다시 평가하기 위해 그룹 배양에 보관됩니다. 배반포 단계에 도달한 배아는 배아학자에 의해 형태학적으로 등급이 매겨집니다. 내부 세포 덩어리(ICM)와 영양 외배엽은 각각 양호(G), 양호(F) 또는 불량(P) 등급으로 지정됩니다. G 또는 F 등급의 배반포는 영양외배엽 생검 및 후속 유리화를 겪게 됩니다. Trophectoderm 생검은 표준 프로토콜을 사용하여 수행됩니다: 내부 세포 덩어리 반대편 부화 영양막 세포는 생검 피펫으로 부드럽게 흡입됩니다. SaturnActive 레이저는 3-5개의 세포를 분리하는 데 사용됩니다. 생검된 세포는 PGT-A 센터 프로토콜에 따라 준비 및 PCR 튜브에 로드되며 테스트 센터로 운송될 때까지 섭씨 -20도에서 보관됩니다.

차세대 시퀀싱은 PGT 검사 센터(Ovation Genetics, Cooper Genomics, Natera, RGI 또는 Genomic Prediction)에서 샘플을 분석하는 데 사용됩니다. 복제 수 변형은 계략 상태를 진단하는 데 사용됩니다. 정배수체는 정상적인 염색체 수로 정의됩니다. 이수성은 비정상적인 염색체 수로 정의됩니다. 모자이크 현상은 30-70% 모자이크 현상으로 정의되는 반면, 30% 미만의 모자이크 현상은 정배수체로 간주되고 70% 이상의 모자이크 현상은 이배수체로 간주됩니다. PGT-A 결과는 정배수체, 이배수체, 모자이크 및 결과가 없는 배아의 백분율에 대해 분석됩니다.