Leendő, randomizált vizsgálat, amely az ICSI-t összehasonlítja a PGT-A-n átesett, nem férfi faktorú betegek megtermékenyítésével

Az intracitoplazmatikus spermiuminjekció (ICSI) egy olyan eljárás, amelyet in vitro megtermékenyítés (IVF) során végeznek, amelynek során egyetlen spermiumot fecskendeznek be közvetlenül egy petesejtekbe. Ezt az eljárást a férfifaktoros meddőség kezelésére fejlesztették ki, mivel nagyon kis számú életképes spermiumra van szükség. A megtermékenyítési arány körülbelül 60-70%, ami a hagyományos termékenyítéshez hasonlítható. Alkalmazása kibővült, és mára IVF-ciklusokhoz ajánlott, amelyek során a blasztocisztákon az aneuploidiákra vonatkozó preimplantációs genetikai vizsgálatot (PGT-A) végzik. A PGT-A segítségével az euploid embriók kiválaszthatók az átvitelre, ami végső soron növeli a beágyazódási arányt, növeli a folyamatos terhesség arányát és csökkenti a vetélések gyakoriságát. Az ICSI minden PGT-A ciklusban történő alkalmazására vonatkozó ajánlás eredetileg a monospermikus megtermékenyítés biztosítására és a polimeráz láncreakció (PCR) genetikai tesztelésre történő alkalmazása során a petesejtek zona pellucidájához kapcsolódó további spermiumok szennyeződésének minimalizálására épült. Ez azonban kevésbé aggaszt az újabb, következő generációs szekvenálási molekuláris technikák esetében, amelyeket ma már használnak, és sokkal nagyobb felbontású elemzést tesznek lehetővé.

Felmerült, hogy az ICSI kis mértékben növelheti a bevésődési rendellenességek és születési rendellenességek kockázatát, és jelentősen megnövelheti az IVF költségeit. A Meiosis II a petesejtek megtermékenyülése során fordul elő, és mint ilyen, a meiózis-berendezés megzavarása potenciálisan kromoszómaosztódási hibákhoz vezethet. Feltételezzük, hogy az ICSI eljárás megzavarhatja a normál meiózis folyamatot, és az aneuploid blasztociszták magasabb arányához vezethet.

Vizsgálatunk véletlenszerűen beosztja azokat a nem férfifaktoros meddőségben szenvedő betegeket, akik IVF-en esnek át PGT-A-val a Texas Termékenységi Központban, vagy hagyományos megtermékenyítésre vagy ICSI-re. A 18-39 éves nők, akiknek a levétele után legalább 10 petesejtjük van, beletartoznak. A kezdeti spermaelemzésnek legalább 16 millió spermium/ml-nek, 42% mozgó spermiumnak, 16,4 millió összes mozgó spermiumnak, 30% progresszív motilitásnak és 4% normál morfológiának kell lennie (a WHO 6. kiadása szerint). A betegek kizárásra kerülnek a következők bármelyike ​​miatt: bármilyen megtermékenyítési vagy egynél több beültetési hiba az előző IVF ciklusokból; férfifaktor meddőség, amelyet a spermiumkoncentráció kevesebb mint 16 millió spermium/ml, a mozgékonyság kevesebb, mint 42%, a teljes mozgékonyság kevesebb, mint 16,4 millió, a progresszív motilitás kevesebb, mint 30%, és a normál morfológia kevesebb, mint 4%; 39 évesnél idősebb női partner; 9 vagy kevesebb petesejtek a visszanyerést követően; olyan párok, amelyek egyetlen génelemzést igényelnek monogén rendellenességek (PGT-M) preimplantációs genetikai vizsgálatával; ICSI a PGT-A-tól eltérő okból.

A női partner ellenőrzött petefészek-stimuláción megy keresztül az egyes betegek orvosa által választott protokoll szerint, a páciens életkora, kórtörténete és petefészek-tartaléka alapján. A stimulációhoz rekombináns tüszőstimuláló hormont (FSH) (Gonal F vagy Follistim) és humán menopauzális gonadotropint (Menopur) fognak használni. Gonadotropin-releasing hormon (GnRH) agonistát (Lupron) vagy antagonistát (Cetrotide vagy Ganirelix) orális fogamzásgátló tablettával (OCP) vagy anélkül, vagy ösztradiollal előállítva kell használni az ovuláció elnyomására. A beteget 1-3 naponként ultrahanggal monitorozzák a tüszőnövekedés és a vér ösztradiol szintjének mérésére, ennek megfelelően állítják be a gyógyszert és az adagolást. A petesejtek érését gonadotropin-releasing hormon (GnRH) agonista (Lupron) és/vagy humán koriongonadotropin (Novarel vagy Pregnyl) váltja ki. A petesejtek visszanyerése a trigger után 36 órával történik a központunkban alkalmazott szabványos protokollok szerint.

A petesejteket többcélú kezelőközeggel (MHM) plusz 0,5% humán szérumalbumint (HSA) kell mosni. A felesleges kumuluszsejteket és a vért levágják. A petesejteket egy Irvine Scientific Continuous Cell Culture Complete táptalajt tartalmazó edénybe visszük át, edényenként két petesejtekkel. Az edény ezután átkerül az inkubátorba.

Az ICSI-re kijelölt petesejteket azonnal hialuronidáznak teszik ki, hogy lehántsák a kumulusz- és koronasejteket. Az embriológusok fordított mikroszkóppal értékelik az érési állapotot. Az ICSI-t minden érett metafázisú II-es petesejteken elvégzik a visszanyerés után 4 órával. Az injektált petesejteket ezután egy friss tenyésztőedénybe helyezik, és visszahelyezik az inkubátorba.

A hagyományos megtermékenyítésre kijelölt petesejtek esetében a megtermékenyítés a kinyerést követően 4-6 órával megtörténik. A spermiumokat friss mintaként gyűjtik, és Irvine Scientific Continuous Single Culture-NX-szel mossák. A spermiumok koncentrációját és motilitását a WHO 6. kiadásának kritériumai szerint mosás előtt és után értékeljük. A spermiumokat úgy készítik elő, hogy 100 mikroliter cseppenként 200 000 spermium koncentrációt érjenek el. Minden edényhez 6 csepp elkészített spermát adunk.

Másnap reggel az ICSI vagy a hagyományos megtermékenyítés után (1. nap) a petesejteket megtermékenyítés szempontjából megvizsgálják. A két pronukleuszos (2PN) zigótákat csoportos tenyészetben tartjuk, hogy az 5., 6. és 7. napon ismét értékeljük őket. A blasztocisztás stádiumot elérő embriókat embriológusaink morfológiailag osztályozzák. A belső sejttömeg (ICM) és a trofektoderma jó (G), közepes (F) vagy gyenge (P) osztályzatot kap. A G vagy F fokozatú blasztociszták trofektoderma biopszián és ezt követően vitrifikáción esnek át. A trofektoderma biopsziát egy szabványos protokoll szerint végezzük: A belső sejttömeggel szemben lévő kikelő trofoblaszt sejteket finoman leszívjuk a biopsziás pipettába. A SaturnActive lézerrel 3-5 sejtet különítenek el. A biopsziás sejteket a PGT-A központ protokollja szerint előkészítik és PCR-csövekbe töltik, és -20 Celsius fokon tárolják a vizsgálóközpontba történő szállításig.

A következő generációs szekvenálást egy PGT-tesztközpontban (Ovation Genetics, Cooper Genomics, Natera, RGI vagy Genomic Prediction) fogják használni a minták elemzésére. A példányszám-változatokat a rendszer a ploiditás állapotának diagnosztizálására használja. Az euploidiát a kromoszómák normál számaként határozzuk meg. Az aneuploidiát a kromoszómák rendellenes számaként határozzák meg. A mozaikságot 30-70%-os mozaikként határozzák meg, míg a 30%-nál kevesebbet euploiditásnak, a 70%-nál nagyobb mozaikságot pedig aneuploidiának tekintik. A PGT-A kimeneteleit az euploid, aneuploid, mozaikos és eredménytelen embriók százalékos arányára vonatkozóan elemzik.